摘要: 植物类病斑是在没有生物或非生物胁迫情况下自发产生的坏死斑，对类病斑突变体的研究可以剖析细胞程序性死亡以及植物防御反应相关途径的调控机制。本研究通过EMS化学诱变处理水稻粳稻品种云稻，从诱变得来的突变体库中筛选到一个可稳定遗传类病斑表型... 展开 植物类病斑是在没有生物或非生物胁迫情况下自发产生的坏死斑，对类病斑突变体的研究可以剖析细胞程序性死亡以及植物防御反应相关途径的调控机制。本研究通过EMS化学诱变处理水稻粳稻品种云稻，从诱变得来的突变体库中筛选到一个可稳定遗传类病斑表型的突变体spl36。利用生理生化和细胞学等实验手段探究基因SPL36如何出现细胞程序化死亡（PCD），利用图位克隆等方式将SPL36定位并通过测序比对发现SPL36突变位点，另外针对确定的候选基因进行功能互补、组织表达分析、亚细胞定位等相关实验。通过接菌实验和防御相关基因的表达量分析进一步探究SPL36功能缺失对植株抗病性的影响。最后对SPL36编码的的蛋白功能进行分析并进行一系列的盐处理实验，探究SPL36是否参与盐胁迫逆境应答。我们实验结果表明，spl36突变体出现细胞程序性死亡和叶片的提前衰老，SPL36参与程序性细胞死亡并通过上调防御相关基因在spl36突变体中诱导了防御反应。同时，水稻SPL36可能负调控盐胁迫相关反应。根据实验数据，我们发现的新的类病斑突变体spl36将有助于阐明细胞程序性死亡和抗病性的调控途径以及水稻耐盐的机制。 具体研究结果如下： （1）spl36的叶片在分蘖期之前与野生型（WT）没有明显变化。在分蘖盛期，类病斑是从叶尖开始出现。从分蘖期到抽穗期，这些坏死斑变得更为严重，并逐渐蔓延到整片叶子。在分蘖盛期用2-3cm铝箔覆盖突变体spl36叶片，另外用未覆盖的突变体叶片作为对照，7天后观察发现遮光的叶片覆盖区内没有出现病斑的蔓延，而未遮光的对照叶片上的类病斑则发生了蔓延。这说明突变体spl36出现的类病斑表型是受到光诱导产生的。同时，突变体spl36的主要农艺性状如株高、每穗粒数和千粒重均显著降低。 （2）突变体spl36的叶绿素a、叶绿素b相比于野生型都极显著下降，进一步对该时期植株光合速率测定，结果表明突变体的净光合速率显著降低。利用透射电镜观察叶绿体超微结构，发现突变体spl36的叶绿体发生了萎缩，叶绿体的体积变小，同时叶绿体内部的片层结构紊乱。 （3）脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验显示突变体spl36细胞核中的TUNEL信号强且随机分布，而在野生型中只检测到较弱的TUNEL信号。此外，突变体spl36中H2O2的含量和丙二醛（MDA）含量显著高于野生型，过氧化物酶（POD）的活性和超氧化物歧化酶（SOD）的活性则显著下降。 （4）在分蘖期对野生型云稻和突变体spl36进行接菌实验，利用剪叶法接种稻白叶枯病菌株HM73。在接种后5天和10天分别观察接菌部位的变化并测量病斑的长度。我们发现在接菌5天后野生型的叶尖出现明显枯斑，而突变体则没有出现明显病斑；接菌10天以后野生型病斑的长度明显长于突变体。通过qRT-PCR检查分蘖时期野生型和突变体中防御相关基因的表达情况，结果显示防御基因MAPK12、WRKY53、BIMK2、AOS2、ASP90、LYP6、PR2、PR1a、PR1b的表达量都显著升高。 （5）遗传分析表明spl36表型是由单个隐性核基因控制的。利用图位克隆的方法将SPL36定位Indel标记InDel1和InDel2之间的一个60kb区域。网站查询（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）预测该区域有11个开放阅读框（ORFs），其中包括了7个表达蛋白，4个功能蛋白。通过测序和比对我们发现基因LOC_Os12g08180出现突变，该基因的编码区1462位核苷酸C替换成T，导致编码的氨基酸由精氨酸变成半胱氨酸，该基因编码一个类受体蛋白激酶前体。 （6）功能互补实验证实SPL36突变是突变体spl36表型出现的原因。进一步使用SPL36的过表达载体（pUbi::SPL36）引入了spl36突变体中，阳性转基因品系中表型完全恢复正常。使用携带SPL36启动子-GUS融合构建体的转基因植物检测SPL36组织表达模式。结果显示，在根、茎、叶、叶鞘和幼穗中检测到GUS信号，这与实时定量PCR的检测SPL36基因在各组织内表达量的结果一致。另外，SPL36的全长编码序列与绿色荧光蛋白（GFP）的N端融合。在水稻原生质体以及本氏烟草叶中瞬时表达，GFP信号出现在质膜上。 （7）对野生型和突变体分别进行平皿盐胁迫和水培苗期盐胁迫实验。平皿实验中，在没有盐处理的情况下，突变体spl36的发芽率和野生型没有明显差别，根上部分长度同样差异不显著。在盐处理情况下，突变体和野生型的发芽率都显著下降，同时野生型的发芽率也显著低于突变体，另外突变体的根上长度显著低于野生型。水培苗期盐胁迫实验，对处理前后植株以及对照组的鲜重、电导率以及最终的存活率进行统计分析发现突变体spl36对盐处理更加敏感，这些结果表明SPL36参与水稻盐胁迫应答反应。 收起