摘要: 多能性干细胞和转基因啮齿类动物是研究发育生物学和疾病发生的重要工具，为许多生命科学基本问题提供了研究模型。多能性干细胞既能无限自我更新，又能分化形成三胚层的细胞，是细胞替代性治疗和再生医学的重要细胞来源和研究细胞分化和胚胎发育的良... 展开 多能性干细胞和转基因啮齿类动物是研究发育生物学和疾病发生的重要工具，为许多生命科学基本问题提供了研究模型。多能性干细胞既能无限自我更新，又能分化形成三胚层的细胞，是细胞替代性治疗和再生医学的重要细胞来源和研究细胞分化和胚胎发育的良好细胞模型，也是建立转基因动物的重要工具。转基因啮齿类动物通过基因功能的缺失与获得建立特定的表型，是研究基因功能和疾病发生机制的有力工具。本研究针对干细胞研究中的若干重要问题，包括干细胞的多能性决定、单倍体胚胎干细胞的获取和利用以及复杂疾病动物模型的制备，利用这些工具建立了几类新的细胞模型和动物模型，并对这些模型在相关研究中的应用进行了初步探索。 首先，我们依据多能性干细胞的体内发育能力，建立了处于不同多能性水平的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell)模型。iPS细胞在再生医学和疾病研究中具有重要的应用前景，但是同样面临一个重要问题，即iPS细胞是否与胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell）一样具有发育全能性，导致其多能性水平差异的机制是什么。针对此问题，我们建立了一批不同细胞来源和不同因子诱导的小鼠iPS细胞系，并通过四倍体补偿实验首次证实了iPS细胞可以产生健康小鼠，因而具有与ES细胞一样的发育能力。在此基础上我们通过二倍体嵌合和四倍体补偿等体内发育能力评估，建立了处于不同多能性水平的iPS细胞模型，为进一步研究iPS重编程引起的干细胞多能性差异的机制提供了基础。 其次，我们针对单倍体在遗传分析上的优越性，探索了单倍体胚胎干细胞系的建立及其在生殖发育和转基因研究中的应用。通过细胞核移植，我们重构了小鼠单倍体胚胎并从中建立了孤雄单倍体胚胎干细胞（androgenetic haploidembryonic stem cells，ahES cells）。AhES细胞兼具单倍性和多能性，具有向三胚层细胞以及生殖细胞分化的能力。进一步研究发现，ahES细胞可以替代精子与卵母细胞融合并产生健康可育的小鼠。我们首次利用卵胞质内注射ahES细胞获得了健康的转基因小鼠，为转基因动物制备和辅助生殖新技术的开发提供新的途径。通过印记基因分析，我们发现这一生殖方式遵循印记基因的调控，可以作为生殖发育的研究模型，开展基因印记、生殖发育调控等相关研究。 转基因动物模型可以让我们在动物整体水平上研究基因功能或疾病发生机制，同时提供了评估包括干细胞治疗在内的治疗手段安全性和有效性的重要工具。因此在细胞水平之外，我们探索了在动物水平上建立特定的转基因啮齿类模型，为生殖发育调控和疾病发生研究提供相关的研究模型。 我们通过基因敲除小鼠模型对雄性生殖过程进行了研究。对于之前鉴定出的一批睾丸特异表达基因，我们针对其中一个候选基因Tex101建立了敲除小鼠，发现Tex101缺失导致雄性不育。进一步研究发现Tex101基因缺失影响若干ADAM蛋白的成熟并导致精子丧失粘附力，从而无法进入输卵管。这说明精子进入输卵管这一生理现象受到严格的分子调控，并且在雄性不育中扮演重要角色。这一研究为男性不明原因不育症的诊断和治疗提供了新的思路，也为避孕药物开发提供了新的分子靶标。 在此之上，我们尝试利用生理水平与人更接近的大鼠进行复杂疾病的模拟。我们建立了HLA-B27转基因SD大鼠，发现群体中没有明显炎症反应;当进行外界炎症刺激，少量转基因大鼠产生严重炎症反应，发病情况与强直性脊椎炎患者相似，显示这一模型在研究由环境与遗传因素互作引发的自体免疫类疾病方面的潜在应用。同时我们利用锌指核酸酶技术建立了Mecp2敲除大鼠模型，初步发现其具有与Meep2敲除Rett综合症小鼠不同的表型，提示Mecp2基因可能存在新功能。这些研究展示了转基因大鼠进行复杂疾病模拟的优越性 综上所述，我们通过四倍体补偿首次证实iPS细胞具有发育全能性，并建立了处于不同多能性水平的iPS细胞模型;建立了小鼠ahES细胞系并通过卵胞质内注射获得首例健康转基因小鼠，从而提供了转基因动物制备的新途径和生殖发育研究的新模型;在动物水平上我们建立了Tex101基因敲除的雄性不育模型并研究其不育的机制;并利用基因修饰大鼠进行了复杂疾病模拟的初步探索。 收起