摘要: 第一章Notch1在肝细胞癌中的表达及其与HBV感染的关系 目的:Notchl广泛表达于多种组织中，与肿瘤的发生发展相关。本研究旨在了解Notchl基因在肝癌发生发展中的作用;分析肝癌致癌机制中乙肝病毒与Notchl相互作用关系;初步探讨Notch1基因在早期诊断... 展开 第一章Notch1在肝细胞癌中的表达及其与HBV感染的关系 目的:Notchl广泛表达于多种组织中，与肿瘤的发生发展相关。本研究旨在了解Notchl基因在肝癌发生发展中的作用;分析肝癌致癌机制中乙肝病毒与Notchl相互作用关系;初步探讨Notch1基因在早期诊断中的价值以及作为肿瘤治疗靶点的可行性。 方法:采用Western-blotting在蛋白水平分别检测80例肝癌和80例正常肝组织中Notchl的表达，其中10例用RT-PCR检测mRNA的表达;采用免疫组化分析Notchl蛋白在石蜡包埋肝癌组织切片中的定位;用PCR检测所有标本HBV感染率，并分析HBX与Notchl在肝癌发病中的相互关系。 结果: Westren blot结果表明，80例肝癌标本中Notchl蛋白表达阳性率为10.0％(8/80)，而80例正常肝组织Notchl阳性表达率为92.5％(74/80);RT-PCR检测结果表明肝癌中Notchl的下调是在mRNA水平;免疫组化结果显示Notchl蛋白在正常肝组织中高表达，定位于细胞浆及胞核内，而肝癌组织则不表达;PCR检测肝癌组织中HBX感染率为81.25％(65/80)，而正常组织中HBV X Protein DNA阳性表达率仅为0.25％(2/80);HBX阴性的肝癌组织中Notchl蛋白表达阳性率高于HBX阴性者（分别46.67％与1.54％），两者差异头统计学意义(P=0.001)，并进一步在RNA水平验证了HBV与Notch l呈负相关关系。Notchl蛋白表达与临床病理因素的关系分析结果表明:Notchl与临床分期相关，两者有统计学差异(P=0.001);而与年龄、肿瘤大、组织分化、淋巴结是否转移及避期疗效无关。 结论: Notchl在肝癌发生发展中发挥抑癌作用，Notchl可阻止HBX诱导的细胞的恶性转化，Notchl下调是HBX诱导的肝癌晚期阶段的重要步骤。Notchl可能有助于肝癌的分期，作为肝癌肿瘤标记物可能性和治疗靶点的可行性尚待进一步研究。 第二章Notchl基因对人肝癌HpeG2细胞增殖和周期的影响及其机制的初步研究 目的: 1、检测Notchl基因对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。 2、探讨Notchl基因影响人肝癌HepG2细胞增殖和周期的可能机制。 方法: 1、利用Notchl-shRNA和真核表达质粒pNotchl-IRES2-EGFP转染人肝癌HepG2细胞，RT-PCR和Western Blotting法筛选和鉴定Notchl表达下调或上调的HepG2细胞。 2、MTT法和PI单染流式细胞术分析Notchl对细胞增殖和细胞周期的影响。 3、采用RT-PCR和Western blotting法检测NF-κβ表达;EMSA法检测NF-κβ的活性。 结果: 1、Notchl-shRNA真核表达载体能有效下调HepG2细胞Notchl的表达，而pNotchl-IRES2-EGFP真核表达载体能有效上调HepG2细胞Notchl的表达。 2、Notchl基因表达上调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P＜0.01)，并引起细胞G1期阻滞(P＜0.01)，S期细胞减少(P＜0.01);在Notchl表达下调的细胞其增殖能力明显增强(P＜0.01)，且引起G1期细胞减少(P＜0.05)，S期细胞增加(P＜0.01)。 3、Notchl基因表达上调的细胞其NF-κβmRNA和蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，NF-κβ DNA结合活性显著降低(P＜0.01);在Notchl表达下调的细胞其NF-κβ mRNA和蛋白表达水平显著增加(P＜0.01)，NF-κβDNA结合活性显著增加(P＜0.01)。 结论: 1、Notchl基因与人肝癌HepG2细胞的增殖能力和周期调控密切相关。 2、Notchl基因可能通过NF-κβ通路影响HepG2细胞的增殖。 第三章藏红花对人肝癌HepG2细胞的作用机制 目的: 观察藏红花提取物对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用并探其机制。 方法: MTT法观察藏红花提取物对肝癌HepG2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测藏红花提取物对HepG2细胞周期的影响;western blot检测藏红花提取物作用前后HepG2细胞中notchl、c-myc、p21、cdk2及cyclinE蛋白表达的变化。 结果: 藏对肝癌HepG2细胞的生长增殖有明显抑制作用，呈浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测显示给药后细胞被阻滞在G0/G1期，western blot分析显示，藏红花提取物作用后HepG2细胞p21和Notchl蛋白表达水平上调，cyclinE、cdk2、c-myc蛋白表达水平下调。 结论: 藏红花提取物可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖，诱导HepG2细胞发生G0/G1期阻滞、凋亡和坏死，周期阻滞作用可能与激活Notch1信号通路有关。 收起