摘要: 背景和目的 原发性肝细胞癌(HCC，hepatocellular carcinoma)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，我国是受肝癌威胁最大的国家，发病率和死亡率约占全球的50%[1]。大量研究表明，肝癌属于放射中度敏感的肿瘤，其敏感性相当于低分化鳞癌。近年随... 展开 背景和目的 原发性肝细胞癌(HCC，hepatocellular carcinoma)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，我国是受肝癌威胁最大的国家，发病率和死亡率约占全球的50%[1]。大量研究表明，肝癌属于放射中度敏感的肿瘤，其敏感性相当于低分化鳞癌。近年随着三维适形放疗等技术的发展，逐渐克服了肝脏放射耐受量低的障碍，放疗在肝癌治疗中的作用也日益受到重视和肯定[2]。但肝癌放疗疗效远不尽人意，如何增加放射敏感性、有效提高肝癌放疗疗效仍是目前亟待解决的热点问题。 MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为19～25个核苷酸(nt)、非编码的单链小分子RNA，由一段具有发夹样环状结构、长约70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经Dicer酶加工后生成[3-4]，广泛分布在病毒、植物、高等哺乳动物中。通过与一种或多种mRNA部分序列碱基互补而在翻译水平上调节这些靶基因的表达[5]。近年多项研究证实，miRNAs表达失调与多种肿瘤相关，并且miRNAs具有肿瘤抑制基因或癌基因的功能[6-9]。不同的肿瘤具有不同miRNAs表达特征谱[10-16]，有研究表明miRNAs的差异表达与肿瘤放疗敏感性密切相关[17-20]，但目前对miRNA的具体作用机制认识有限，如具体分子机制能得以阐明，miRNAs联合放疗将成为一种非常具有潜力和临床应用价值的治疗手段。 miR-122a定位于人染色体的18q21.31，是肝脏特异性高表达miRNA，约占成年个体肝脏总miRNAs的70%[21]，每个肝细胞表达量达66000拷贝以上，参与肝细胞分化、增殖、凋亡等众多生物学过程，有研究发现miR-122a在70%肝癌组织和肝癌来源的细胞系中表达下调[22]，并证实miR-122a在肝癌的发生发展过程中有重要作用[22-28]。在我们课题组的前期研究中，利用miRNA芯片技术筛选肝癌细胞HepG2和正常肝上皮细胞LO2中miRNAs的差异表达谱，发现在HepG2细胞中miR-122a呈低表达，并且有研究表明miR-122a表达水平的改变可以使肝癌细胞株对化疗药物的敏感性发生变化[29]，而miR-122a与肝癌放疗的关系国内外尚没有相关报道。因此本课题主要探索miR-122a的功能及其与肝癌细胞放疗敏感性的关系。 研究miRNA作用机制的关键是正确认识miRNA及其靶基因的相互作用。我们利用miRNA靶标基因数据库miRGen3.0[30]对miR-122a的靶基因进行预测，并对其靶基因进行功能富集分析(GO-Analysis)、信号转导通路富集分析(Pathway-Analysis)和蛋白质相互作用网络分析，从而为寻找调控肝癌细胞放疗敏感性相关的靶基因提供依据。 为了进一步研究miR-122a对肝癌细胞放疗敏感性的作用以及分子机制，我们从预测的miR-122a靶基因中筛选出与放射敏感性密切相关的两个分子cyclin G1和APE1进行分析。cyclin G1是新近发现的一种细胞周期蛋白，在多种肿瘤中高表达，其基因启动子内包括两个p53蛋白的结合位点，是“p53-细胞周期”信号转导通路的重要效应分子，其主要作用是调控细胞周期G2/M期的转换，参与了肿瘤的损伤修复，并与肿瘤细胞放疗抵抗作用密切相关。目前有文献报道证实cyclin G1为miR-122a的靶基因，因此，miR-122a也可能通过作用于cyclin G1在调控肝癌细胞放射敏感性中发挥作用。APE1是DNA碱基切除修复途径(BER)的关键限速酶，主要负责由电离辐射和基因毒性药物如烷化剂引起的细胞核及线粒体基因组DNA损伤，参与和调节众多生物学过程，包括细胞生长和分化、细胞凋亡以及肿瘤放疗抵抗性[31]。本课题组前期已经对APE1功能进行了系统的研究，确定APE1在肿瘤放疗抵抗中发挥核心作用[32-33]，因此，验证miR-122a调控APE1表达是阐明miR-122a参与肝癌细胞放射敏感性作用的重要机制。本课题利用细胞周期分析、MTT、克隆形成分析、细胞凋亡等技术和方法分析miR-122a对肝癌细胞的细胞周期、增殖与凋亡等生物学行为的干预作用，并进一步利用慢病毒转染、蛋白表达等方法探讨miR-122a和cyclin G1、APE1之间的作用及其与p53的关系，初步验证miR-122a参与调控肝癌细胞放疗敏感性的作用及其可能分子机制，为揭示miR-122a在肝癌中韵生物学功能，解决临床肿瘤患者的放疗增敏作用提供理论和实验依据。 方法： 1.应用不同的生物信息学方法对miR-122a的靶基因进行预测，并对其靶基因进行功能富集分析、信号转导通路富集分析和蛋白质相互作用网络分析。 2.应用miR-122a过表达慢病毒载体使不同p53表达状态的肝癌细胞株中的miR-122a表达升高。 3.利用细胞周期分析、MTT、克隆形成分析、细胞凋亡等技术和方法分析miR-122a对电离辐射前后的不同p53表达状态的肝癌细胞的细胞周期、细胞增殖与凋亡等生物学行为的影响。 4.应用Western blot法分析miR-122a与APE1、cyclin G1蛋白表达的相关性。 5.应用双荧光素酶报告基因实验验证APE1是否为miR-122a的直接作用靶基因。 结果： 1.目前预测miR-122a的靶基因有1104个，其靶基因涉及细胞周期、信号转导、细胞增殖、分化和细胞凋亡等众多生物学过程。 2.miR-122a对Hep3B的细胞周期进程有明显的阻滞作用，而对HepG2细胞周期进程无明显影响。 3.miR-122a抑制电离辐射后细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡。 4.肝癌细胞株中miR-122a的表达升高后，Hep3B细胞中的cyclin G1的表达明显降低，而HepG2细胞中的cyclin G1的表达无明显变化。 5.肝癌细胞株中miR-122a的表达升高后，APE1在Hep3B、HepG2细胞中的表达无明显变化。 结论： 1.生物信息学分析发现miR-122a的靶基因涉及细胞周期、信号转导、细胞增殖、分化和细胞凋亡等众多生物学过程。 2.过表达miR-122a可增加肝癌细胞的放疗敏感性，其具体机制可能通过下调直接作用靶基因cyclin G1，使细胞周期阻滞于G2/M期，这种调节作用与p53基因表达状态相关。 收起