摘要: 随着生活水平的提高，心血管疾病已经成为威胁人类健康和生命的主要杀手。长时间的心肌缺血可使组织损伤甚至细胞死亡，解决缺血损伤的关键是冠状动脉再通，但是长时间的心肌缺血后的再灌注往往会导致更严重的损伤，这种现象称之为心肌缺血再灌注(isc... 展开 随着生活水平的提高，心血管疾病已经成为威胁人类健康和生命的主要杀手。长时间的心肌缺血可使组织损伤甚至细胞死亡，解决缺血损伤的关键是冠状动脉再通，但是长时间的心肌缺血后的再灌注往往会导致更严重的损伤，这种现象称之为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。缺血再灌注损伤是冠状动脉再通术如溶栓、PTCA或搭桥术后重要的并发症。如何既能保证恢复缺血组织的血流灌注，同时又能减轻I/R损伤的发生成为了目前研究的热点问题。 1986年，Murry提出缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)的概念，即在对心肌进行长时间缺血前，先对心肌进行几次短暂性的缺血，心肌可耐受此后更长时间的缺血现象。然而，由于IPC潜在的危险性及在临床实际中的不可操控性，使得IPC的临床应用受到局限。随后研究人员发现多种药物可以模拟IPC产生确切的心肌保护效应，如:挥发性麻醉药七氟烷、阿片类镇静药、他汀类药物等，即药物预处理。由于药物预处理可扩大使用范围，节省处理时间，更适于临床应用。 他汀类药物是动脉粥样硬化治疗过程中最重要的药物。研究表明，长期使用他汀类药物的患者不仅能改善远期预后，还可降低PCI术后心肌损伤标志物升高的水平。近2年的临床随机对照试验迸一步表明，PCI手术前24小时给予1次较大剂量的他汀类药物（无论是否正在应用他汀类药物）可明显降低PCI术后心肌损伤标志物的升高。他汀类药物的这种即时心肌保护作用很可能是通过药物模拟的缺血预适应实现的，如果这个假设成立，那么应该一个剂量的他汀类药物即可出现心肌保护效果。在本研究中，我们拟建立在体大鼠I/R、离体大鼠I/R及原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，明确单次负荷量阿托伐他汀(atorvastatin，Ator)预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并进一步探讨Ator心肌保护的可能机制。通过以上研究，进一步为Ator防治心肌缺血再灌注损伤提供实验依据，并且为临床心肌保护提供新的治疗途径。 实验内容主要包括以下三部分: 第一部分单次负荷量阿托伐他汀预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响 目的: 研究单次负荷量阿托伐他汀预处理是否能够模拟缺血预适应对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤发挥心肌保护作用。 方法: 56只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为8组，每组7只，其中每组中1只用于留取心肌组织的电镜标本。制备阿托伐他汀生理盐水混悬液(20 mg/ml)，按照80 mg/kg灌胃，每只大鼠约需1.0 ml。 (1)假手术组（sham组）:等量生理盐水灌胃，开胸暴露心脏，于左心耳与主动脉之间找到前降支，于距前降支起点2-3 mm处穿线，不结扎前降支; (2)缺血再灌注组（I/R组）:等量生理盐水灌胃，开胸暴露心脏，于前降支近端同一部位处采用套管法完全阻断前降支血流30min，随后再恢复前降支血流灌注120 min; (3)缺血预适应组（IPC组）:等量生理盐水灌胃，缺血再灌注前，给予同部位阻断前降支5 min，复灌5 min，循环3次，再次阻断前降支血流，缺血30 min，复灌120 min; (4)阿托伐他汀预处理组(Ator组):术前给予Ator80 mg/kg灌胃，分别于灌胃后3h、6h、12h、24 h、48 h时结扎前降支，缺血30 min，再灌注120 min，最终选取不同时间点中心肌梗死面积最小组作为Ator预处理组。 本实验采用在体大鼠心脏开胸暴露冠状动脉的前降支，并于前降支近端穿线结扎前降支30 min，再灌注120 min的方法制备在体大鼠I/R模型;采用缺血5 min，复灌5 min，反复循环3次，制备IPC模型。采用伊文思蓝(Evans Blue)标记心肌缺血范围，以2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）标记心肌梗死范围，并采用面积计算法计算心肌缺血区和心肌梗死区的范围;于再灌注120 min结束时，于肺动脉取血1-2 ml，离心，光化学法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性;透射电子显微镜观察不同处理组心肌细胞超微结构及线粒体损伤程度。 结果: 1、心电图ST-T变化情况 I/R组结扎前降支后心电图ST段弓背向上抬高，与T波融合，呈墓碑样改变。Sham组手术前后心电图无明显变化。 2、I/R组与Ator预处理各组梗死面积的比较 与I/R组相比，Ator6组、Ator12组、Ator24组、Ator48组的心肌梗死面积显著减少(P＜0.05)，其中Ator12组较Ator48组心肌梗死面积显著减少（P＜0.05），较Ator6组、Ator24组心肌梗死面积有减少趋势，但无统计学差异（P＞0.05）;Ator3组的心肌梗死面积与I/R组比较未见统计学差异(P＞0.05)。依据上述实验结果，最终选择Ator12组作为Ator预处理组。 3、各组心肌缺血范围的比较 缺血区范围用缺血区(area at risk)与左心室(left ventricular)面积比来测定。用AAR/LV表示缺血区与左心室面积比。 与I/R组相比，IPC组、Ator组的缺血区范围（AAR/LV）显著减少(P＜0.05);与IPC组相比，Ator组的缺血范围有增大趋势，但未见统计学差异(P＞0.05)。 4、各组心肌梗死范围的比较 梗死范围大小用心肌梗死区(infarct area)与缺血区(area at risk)面积比来表示。用IA/AAR表示梗死区/与缺血区面积比。 与I/R组相比，IPC组、Ator组的梗死区范围(IA/AAR)显著减少(P＜0.05);IPC组与Ator组的梗死区范围相比无统计学差异(P＞0.05)。 5、各组LDH活性的比较 与I/R组相比，IPC组、Ator组的LDH的活性均显著下降(P＜0.05);与IPC组相比，Ator组的LDH活性显著增加(P＜0.05)。 6、各组心肌超微结构的改变 Sham组心肌组织结构及线粒体等超微结构正常，肌原纤维与嵴突排列整齐，线粒体多而密集，糖原颗粒丰富;I/R组肌原纤维重度水肿，结构紊乱，线粒体肿胀明显、膜完整性丧失，糖原颗粒减少;IPC组心肌组织较I/R组损伤明显减轻，肌原纤维肿胀不明显，肌膜遭到破坏，线粒体结构基本正常且密集分布，嵴突数目较多，糖原颗粒较丰富;Ator组心肌细胞轻中度水肿，肌膜肿胀较轻，部分肌原纤维及肌丝排列不规则，线粒体总体结构尚可，轻度水肿，嵴突数目变少、排列紊乱，糖原颗粒较多。 结论: 1、单次负荷量Ator（80 mg/kg）预处理能够减轻在体大鼠心肌缺血再灌注损伤，其最大保护作用出现于灌胃后12小时左右。 2、在心肌缺血再灌注损伤保护作用方面，单次负荷量Ator预处理并不优于缺血预适应。 第二部分阿托伐他汀预处理对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究 目的: 探讨阿托伐他汀预处理对离体大鼠全心缺血再灌注损伤是否具有心肌保护效果及线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP channels)和线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)在其中的作用。 方法: 用K-H缓冲液逆行灌流离体SD大鼠心脏，全心缺血30 min后复灌120 min建立离体缺血再灌注损伤模型。应用mitoKATP通道的阻断剂5-HD(5-hydroxydecanoic acid)或mPTP的开放剂氯尼达明(lonidamine，LND)，用以评价mitoKATP通道和mPTP在Ator预处理中的作用。 SD大鼠随机分为以下7组: (1) control组:持续灌流。 (2) I/R组:心脏进行全心缺血30 min，再灌注120 min。 (3) Ator预处理组:分别于全心缺血前15 min，30 min，60 min或120 min灌流Ator（1μM），确定Ator最佳保护用药时间;全心缺血前分别给予Ator0.01μM，0.1μM，1μM，10μM灌流30min（Ator最佳用药时间为30 min），确定Ator最佳保护用药浓度。 (4) Ator+5-HD组:心脏首先灌流5-HD(100μM)20 min，然后全心缺血前预处理Ator(1μM)30 min。 (5) Ator+LND组:全心缺血前预处理Ator（1μM）30 min，在再灌注开始时给予LND（30μM）20 min。 (6) 5-HD组:心脏首先灌流5-HD（100μM）20 min，然后全心缺血前灌流K-H缓冲液30 min。 (7) LND组:在再灌注开始时给予LND(30μM)20 min。 比较各组间的血流动力学、心肌梗死面积、冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)活性及心肌组织ATP含量。再灌注20 min后测定心肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量以反映mPTP的开放情况。透射电子显微镜观察不同处理组心肌细胞超微结构及线粒体损伤程度。 结果: 1、Mor对缺血再灌注后心肌梗死面积的影响 与I/R组相比，Ator15，Ator30，Ator60明显减少心肌梗死面积（P＜0.05）。Ator120与I/R组相比无统计学差异(P＞0.05)。与Ator30相比，Ator15，Ator60心肌梗死面积明显增加（P＜0.05），说明Ator最佳保护作用的用药时间为30 min。 与I/R组相比，四种不同浓度的Ator预处理均明显减少心肌梗死面积（P＜0.05）。其中，1μM的Ator预处理心肌保护作用最佳。5-HD或LND的联合应用取消了Ator减少心肌梗死面积的作用（P＜0.05）。与I/R组比较，单独给予5-HD或LND对心肌梗死面积无明显影响(P＞0.05) 2、Ator对血流动力学的影响 7组离体心脏平衡期血流动力学指标比较没有统计学差异(P＞0.05)。缺血30 min，再灌注120 min后，心功能指标均较平衡期基础值减退。主要表现在左心室收缩压(LVSP)，左心室压力最大变化速率（dp/dtmax，-dp/dtmax）和心率(HR)降低，左心室舒张末压(LVEDP)升高。Ator（1μM）组血流动力学的各项指标均优于I/R组（P＜0.05）。然而，Ator预处理对心功能的保护作用可被5-HD或LND完全阻断。 3、Ator对LDH的影响 与control组相比，I/R组心脏再灌注后冠脉流出液中LDH活性明显上升(P＜0.05)。Ator预处理可显著降低LDH活性，5-HD或LND与Ator联合应用时，均阻断了Ator降低LDH的作用。与I/R组比较，单独给予5-HD或LND对LDH活性无明显影响(P＞0.05)。 4、Ator对离体心脏缺血再灌注后心肌内ATP水平的影响 与control组相比，I/R组内ATP水平显著降低（P＜0.05）。 Ator预处理组较I/R组心肌内ATP水平显著升高（P＜0.05），Ator升高ATP的效果被5-HD或LND所抑制。 5、Ator对mPTP开放的影响 再灌注20 min后，control组心肌NA 收起