摘要: 1.研究背景 贲门腺癌(GCA)是我国北方特别是河南林州、安阳等地区最常见的恶性肿瘤之一。早期GCA患者5年生存率可高达90％，中晚期患者5年生存率仅10％左右。但临床80％以上就诊的GCA患者均为中晚期。导致GCA预后极差。贲门腺癌的病因不明，遗传因... 展开 1.研究背景 贲门腺癌(GCA)是我国北方特别是河南林州、安阳等地区最常见的恶性肿瘤之一。早期GCA患者5年生存率可高达90％，中晚期患者5年生存率仅10％左右。但临床80％以上就诊的GCA患者均为中晚期。导致GCA预后极差。贲门腺癌的病因不明，遗传因素与环境因素在贲门癌发生过程中的作用仍不清楚。也是导致其死亡率多年无明显改善的主要原因之一。尽管国内外学者多年来对贲门腺癌易感基因进行大量的研究，但因为缺乏高通量检测技术，故仍未取得突破性进展。 全基因组关联研究(GWAS)技术的问世，正好解决这一技术难题。GWAS是利用高通量基因分型技术分析数以万计的单核苷酸多态性(SNPs)以及这些SNPs与临床表现和可测性状的相关性，对大样本资料进行检测分析，旨在寻找与疾病相关性密切的一组基因。利用GWAS搜寻复杂疾病的易感基因，是学术界公认的目前最有效的方法。自2005年以来，国际上利用GWAS对百余种常见疾病进行研究，包括恶性肿瘤，如前列腺癌、肺癌等以及糖尿病、肥胖、精神疾病进行易感基因的筛选研究，取得一定成绩。在GWAS贲门癌方面的研究仅见我们团队自己的报道。 本研究通过贲门癌大样本流行病学调查，分析中国汉族人群GCA遗传倾向(家族史)的分布特征和规律。并利用GWAS技术寻找验证贲门癌易感基因，在分子水平探讨中国汉族人群发生GCA的基因多态性改变，并分析吸烟、饮酒、体重指数(BMI)、幽门螺杆菌(Hp)等因素对中国人群GCA发病的影响，为筛选贲门癌变关键候选基因和蛋白、建立高危人群预警和个体化预防的分子指标提供重要的理论依据。 2.材料及方法 2.1 GCA遗传倾向(家族史)研究 2.1.1研究对象:共调查贲门癌患者16470例。其中，男性12804例，平均61±9岁；女性3666例，平均61±9岁。所有资料来自河南安阳、林州、新乡等省内30余家医院，河北、广东、四川、云南等省外15余家医院确诊贲门癌的住院病人。 2.1.2研究方法:采取问卷调查方式，所有结果采用EXCEL软件进行数据录入。采用SPSS17.0统计软件处理，组间比较采用x2检验(α=0.05)。 2.2全基因组关联分析(GWAS) 2.2.1研究对象:共收集贲门癌及健康对照血标本13779例(男7782例，女5997例)，其中病例组2766例(男2144例，女622例，平均年龄61±9岁)，对照组11013例(男5638例，女5375例，平均年龄48±14岁)。研究对象来源同本研究第一部分，病例组均经组织学证实，所有患者均未进行过放疗和化疗。对照组来源同上，经胃镜检查排除早期癌。 2.2.2研究方法:用德国QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取血液样本基因组DNA，准确测定每份待标化样本DNA的浓度，浓度要求15ng-20ng/μl，OD值在1.7-2.0之间。选择Sequenom iPLEX芯片验证。 计算样本得率、SNP得率、最小等位基因频率(MAF)、哈迪·温伯格(HWE)平衡律。对质控后的数据用Plink1.03软件分析并输出结果，用Cochran-Armitage趋势检验计算P值、优势比(Odds ratio，OR)和95％可信区间(95％CI)。吸烟、饮酒、BMI等亚组分析使用SPSS17.0统计软件处理，进行x2检验、Logistic回归分析(α=0.05)。 2.3免疫组织化学研究 2.3.1研究对象:取贲门癌组织50例，癌旁不典型增生17例，正常对照组织13例，经常规85％酒精固定、石蜡包埋、切片厚4μm2张，分别做HE染色和免疫组化染色。 一抗为美国Sigma公司提供的兔抗人磷脂酶CE1(PLCE1)多克隆抗体，ABC试剂盒为Vector公司产品。每批实验都设阳性对照和阴性对照。 2.3.2统计学方法:采用SPSS17.0统计软件处理，组间的比较采用x2检验(α=0.05)。 3.结果 3.1贲门腺癌遗传倾向(家族史)调查结果 3.1.1不同性别GCA肿瘤家族史特征:贲门癌家族史阳性(FH+)占22％(3669/16470)，其中，男性FH+占22％(2870/12804)，女性FH+占22％(799/3666)，统计学分析性别间无显著差别。 3.1.2高、低发区GCA患者发病年龄与肿瘤家族史特征:高发区贲门癌患者发病年龄均数显著小于低发区患者；男性GCA患者发病年龄均数比较，高发区亦显著小于低发区；女性GCA患者中，两组相比无显著差异。 小于60岁(包括60岁)GCA患者高发区所占比例显著高于60岁以上组；男性GCA患者中，小于60岁高发区患者所占比例显著高于60岁以上组；女性GCA患者中，两组相比无显著差异。 高发区患者FH+明显高于低发区(28％，3095/11187 vs.16％，574/3608)，统计学分析有显著差别。 3.1.3发病年龄与GCA肿瘤家族史关系分析:家族史阳性贲门癌患者发病年龄均数显著小于家族史阴性患者；男性GCA患者发病年龄均数比较，家族史阳性者亦显著小于家族史阴性者；女性GCA患者中，两组相比无显著差异。 小于50岁(包括50岁)GCA患者中FH+者所占比例显著高于50岁以上组；男性GCA患者中，小于50岁(包括50岁)FH+者所占比例显著高于50岁以上组；女性GCA患者中，两组相比无显著差异。 3.2全基因组关联分析结果:中国汉族人群13779例样本(2766例病例和11013例对照)中，经GWAS高通量重复验证，筛选出2个新的易感位点：rs2274223和rs13042395。经一系列比对分析后，将rs2274223定位于10q23的phospholipase C epsilon1(PLCE1)基因，rs13042395定位于20p13的chromosome20 opening reading frame54(C20orf54)基因。 3.2.1亚组分层分析：基因多态性和吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒关系分析PLCE1基因rs2274223位点基因型频率病例组和对照组之间x2检验发现：分布差异非常显著。对基因型进行Logistic回归分析后发现：吸烟/不吸烟、饮酒/不饮酒人群，GG、GA基因型与GCA均具有显著相关。经多因素调整后，吸烟人群和不饮酒人群仍存在显著相关；不吸烟人群和饮酒人群GG基因型仍存在显著相关，GA基因型无显著相关。 3.2.2亚组分层分析：基因多态性和BMI关系分析PLCE1基因rs2274223位点基因型在病例组和对照组的Ⅰ级/Ⅱ级BMI人群中进行Logistic回归分析后发现：GG、GA基因型与GCA均显著相关。Ⅲ级BMI人群Logistic回归分析后发现：GG、GA基因型与GCA均无显著相关。 3.2.3亚组分层分析：基因多态性和Hp感染关系分析PLCE1基因rs2274223位点基因型在病例组和对照组的Hp感染阳性/阴性人群中进行Logistic回归分析后发现：GG、GA基因型与GCA均显著相关；多因素调整后结果显示：Hp感染阴性人群中GG、GA基因型与GCA的患病风险显著相关；Hp感染阳性人群中GG基因型与GCA发病风险相关，而GA基因型无显著统计学差异。 3.2.4 PLCE1基因rs2274223位点基因型与家族史、性别、高低发区、不同年龄人群中进行Logistic回归分析后发现：GG、GA基因型与GCA均显著相关。经多因素调整后，亦有一定的相关性。 3.2.5 C20orf54基因多态性rs13042395位点基因型频率病例组和对照组之间x2检验发现，其基因型分布有显著性差异。在吸烟/非吸烟、饮酒/非饮酒等人群中进行Logistic回归分析，结果显示，该位点基因型与GCA无显著相关。 3.3免疫组织化学染色结果正常贲门组织已出现明显PLCE1蛋白表达，但不典型增生(DYS)(88％，15/17)和GCA组织(72％，36/50)中PLCE1蛋白表达阳性率显著高于正常组织(23％，3/13)。PLCE1蛋白阳性表达率与临床病理特征如TNM分期、分化程度和淋巴结转移等关系不明显。 4.结论 4.1通过大样本的GWAS研究，在国际上首次发现与中国汉族人GCA发病风险显著相关的2个重要SNP易感位点rs2274223、rs13042395，并分别定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因上。 4.2中国汉族人群PLCE1基因多态性位点rs2274223基因型为GG、GA者发生GCA的风险较AA型高，其中GG基因型是风险因素，GA基因型是条件风险因素。吸烟、不饮酒、Ⅰ级/Ⅱ级BMI、无Hp感染等因素均可能增加GA基因型人群患GCA的风险。 4.3Ⅲ级BMI可能是GCA的保护因素。 4.4中国汉族人群C20orf54基因多态性位点rs13042395与GCA发病风险有关，但与吸烟、饮酒、BMI等因素之间无相互作用。 4.5 PLCE1免疫组化结果提示，PLCE1在贲门癌变过程中可能起重要作用。 4.6贲门癌具有明显家庭聚集现象，家族史阳性贲门癌患者平均发病年龄明显小于家族史阴性患者，提示遗传因素在贲门癌发生过程中起一定作用。 收起