摘要: 目前微生物饲料添加剂已商业化运作，并取得了一些成功的效果，但因品牌鱼目混珠，在品质上良莠不齐。所以针对目前的这种状况，建立规范性的微生物饲料添加剂品质的高通量快速检鉴方法尤为重要。用规范性的检鉴方法对微生物饲料添加剂的品质进行把关... 展开 目前微生物饲料添加剂已商业化运作，并取得了一些成功的效果，但因品牌鱼目混珠，在品质上良莠不齐。所以针对目前的这种状况，建立规范性的微生物饲料添加剂品质的高通量快速检鉴方法尤为重要。用规范性的检鉴方法对微生物饲料添加剂的品质进行把关，进而找出从原料供应、菌种来源及菌种活性到生产工艺流程，再到后续加工、包装运输等各个环节的薄弱之处，进行逐一优化升级，保证产品的质量。 本课题以我国在1999年发布的允许使用的饲料添加剂种类目录中允许添加的最常见的9种微生物为研究对象，采用传统的微生物培养方法、生理生化鉴定方法、分子生物学方法对这9种微生物进行标准检鉴流程的建立。 建立高通量的快速检鉴方法，对微生物饲料添加剂中的益生菌同时进行定性和定量检鉴，结果直观。并形成通用性较好的快速检鉴试剂盒，便于后期投入商业化生产。 对于需要2次增菌的检鉴，制作一种密闭的设备，将转接过程中的交叉污染降为0，并且实现零泄漏的废弃物处理方式，保证生物安全。并便于后期投入商业化生产。 对市面上销售的微生物饲料添加剂进行益生菌的定性定量检鉴，和致病菌的检鉴，并对检出的致病菌进行进一步的生化以及分子生物学分析。 通过实验得出如下成果和结论： 1．应用本论文中研发的试剂盒，通过普通PCR检鉴技术，可以对乳酸片球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母这9种标准菌株实现无增菌培养条件下的定性和定量检鉴。检鉴结果的特异性较好。检鉴灵敏度是：105cfu/mL～107 cfu/mL。 2．密闭培养袋，可以满足2次增菌检鉴的需要，比如沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌的检鉴，通过对密闭培养袋中自带的84消毒剂和威露士消毒液的杀菌效果评价发现，无害化生物安全处理效果符合卫生部《消毒技术规范》（2008版）的要求，即：84消毒液在浓度为2%和3%时，作用5min，可使试验菌株数量从108下降至102，符合欧洲标准对消毒剂杀菌效果的评价要求。 3．对目前买到的市售微生物饲料添加剂商品进行检鉴，都检出了大肠杆菌（都非含NDM-1基因的大肠杆菌）。有一票检出了阪崎肠杆菌，2票检出肠球菌，3票检出金黄色葡萄球菌（都非抗甲氧西林和抗万古霉素基因的金黄色葡萄球菌），21票都有霉菌检出。 4．此试剂盒可以在无培养条件下，直接对样品中的这9种添加菌株进行定性和定量的检鉴。检鉴结果与标准菌株检鉴结果一致。初步可以胜任检鉴工作。 收起