摘要: 研究目的：1建立机械性创伤大鼠模型；TNF-a、肾上腺素损伤大鼠模型；拉贝洛尔干预大鼠模型。2 观察机械性创伤时肺组织中FoxA1mRNA和蛋白质的表达改变及肺组织中肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。3 观察TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1mRNA、蛋白... 展开 研究目的：1建立机械性创伤大鼠模型；TNF-a、肾上腺素损伤大鼠模型；拉贝洛尔干预大鼠模型。2 观察机械性创伤时肺组织中FoxA1mRNA和蛋白质的表达改变及肺组织中肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。3 观察TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1mRNA、蛋白质表达的影响及大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。4 研究TNF-a、肾上腺素对大鼠肺组织中FoxA1mRNA、蛋白质表达的影响及大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。 研究方法：1机械性创伤对大鼠肺组织FoxA1mRNA和蛋白及大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响建立非致死性机械性创伤模型：麻醉大鼠后，将其置于Noble-Collip 创伤仪（直径12英寸），以40rpm的转速，旋转200圈，造成大鼠非致死性创伤。以ELISA 法检测大鼠血清中TNF-a、肾上腺素含量；使用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测创伤组和伪创伤组大鼠肺组织FoxA1mRNA的表达的变化；对大鼠肺组织切片进行TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标志物SP-C 染色检测大鼠肺组织中凋亡的肺泡Ⅱ型上皮细胞。2 TNF-a、肾上腺素体内实验对肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响建立TNF-a、肾上腺素损伤离体细胞模型：100ng/mlTNF-a和2000ng/ml 盐酸肾上腺素刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞。运用荧光定量PCR、免疫蛋白印迹检测TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1mRNA、蛋白质表达，同时运用流式细胞术检测大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡。3 TNF-a、肾上腺素体内实验对肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响建立TNF-a、肾上腺素损伤大鼠模型：向大鼠腹腔分别注射TNF-α（2.5ug/kg）、盐酸肾上腺素（1ml/kg）；拉贝洛尔干预模型：在给大鼠灌胃盐酸拉贝洛尔后3h、6h、24h后再放入Noble-Collip 创伤仪以40r/min 转动200圈造成机械性创伤。运用免疫蛋白印迹检测这三种模型中大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1蛋白质表达，通过TUNEL和SP-C免疫组化染色对比，检测大鼠肺组织中肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡，同时运用ELISA 法检测三种大鼠模型中血清中TNF-a、肾上腺素含量。 研究结果：1机械性创伤对大鼠肺组织FoxA1mRNA和蛋白及大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响1.1机械性创伤对大鼠分泌肾上腺素和TNF-α的影响以ELISA 法检测大鼠血清中TNF-a、肾上腺素含量，创伤后各时间点血清中肾上腺素和TNF-α含量逐渐上升，分别于创伤后6h和3h 达高峰，峰值为（1.7560±0.1311）ng/ml和135.0898±1.5349(ng/l)，差异有统计学意义（P<0.01）1.2 机械性创伤致继发性肺损伤对FoxA1mRNA和蛋白质表达的影响使用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测创伤组和伪创伤组大鼠肺组织FoxA1mRNA的表达的变化。结果显示创伤组FoxA1mRNA表达较伪创伤组增高，FoxA1蛋白表达在创伤组均高于伪创伤组，于创伤后24h 达到高峰（P<0.01）。1.3 机械性创伤对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标志物SP-C 染色结果表明大鼠创伤后出现肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。2 TNF-a、肾上腺素对离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响2.1TNF-a、肾上腺素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1mRNA的表达影响使用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测各组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞FoxA1mRNA和蛋白质的表达的变化。结果显示盐酸肾上腺素、TNF-a 刺激后FoxA1mRNA和蛋白表达明显上升，24小时达到高峰。差异有统计学意义（P<0.01）。2.2 TNF-a、肾上腺素对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测了100ng/mlTNF-a和2000ng/ml 盐酸肾上腺素刺激大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞后的凋亡率，结果表明，两组刺激12小时后大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著上升，与对照组比较差异有统计学意义。3 TNF-a、肾上腺素体内实验对肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响3.1TNF-a、肾上腺素对肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响使用实时荧光定量PCR和western blot 检测各组FoxA1蛋白的表达情况，结果显示，FoxA1蛋白表达在TNF-a 注射组、盐酸肾上腺素注射组均高于生理盐水对照组，于创伤后6h 达到高峰，差异有统计学意义（P<0.01）以ELISA 法检测大鼠血清中TNF-a、肾上腺素含量，结果显示，TNF-a 注射组、盐酸肾上腺素注射组与生理盐水对照组相比含量明显增高，差异有统计学意义（p<0.01）TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标志物SP-C 染色结果表明腹腔注射TNF-a、盐酸肾上腺素出现肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，并且于12小时到达高峰。3.2 拉贝洛尔对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响以western blot 检测（β-actin为内参对照）各组中FoxA1蛋白的表达情况，FoxA1蛋白表达在盐酸拉贝洛尔灌胃组均低于创伤组，差异有统计学意义（P<0.01）。血清中肾上腺素含量的检测结果：拉贝洛尔干预组与创伤组相比含量明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）;血清中TNF-α含量的检测结果：拉贝洛尔干预组与创伤组相比含量显著明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）。TUNEL和肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标志物SP-C 染色结果表明拉贝洛尔干预组与创伤组相比肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡明显减少。 研究结论：1机械性创伤使大鼠血清中TNF-a、肾上腺素水平显著升高并且大鼠肺组织中FoxA1表达上调，导致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。2 TNF-a、肾上腺素刺激的肺泡Ⅱ型上皮细胞中FoxA1表达上调。FoxA1在TNF-a、肾上腺素诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中具有重要作用。3 肾上腺素、TNF-a水平增高引起的肺损伤类似于机械性创伤所导致的继发性肺损伤，并且出现肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。4 拉贝洛尔可以通过抑制交感神经活性减少肾上腺素的释放，降低TNF-a的水平，减少肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡从而减轻机械性创伤所导致的继发性肺损伤。5 机械性创伤可以引起机体TNF-a、肾上腺素水平升高，其中TNF-a、肾上腺素又有相互促进作用，加重肺损伤程度，使肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡。6 拉贝洛尔对机械性创伤导致的继发性肺损伤有保护作用。 收起