摘要: a2-HS糖蛋白(Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)是一种存在于人体血清中的一种糖蛋白,目前的研究显示,原发性肝癌患者血清中该蛋白的自身抗体水平显著高于正常人,提示其有可能成为诊断原发性肝癌的一种血清学标志物。本研究通过原核表达的方... 展开 a2-HS糖蛋白(Alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)是一种存在于人体血清中的一种糖蛋白,目前的研究显示,原发性肝癌患者血清中该蛋白的自身抗体水平显著高于正常人,提示其有可能成为诊断原发性肝癌的一种血清学标志物。本研究通过原核表达的方法获得AHSG重组蛋白,并用其作为肿瘤相关抗原检测原发性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中抗AHSG抗体的水平,评价其单独和并联其它肿瘤相关抗原作为原发性肝癌诊断指标的价值。 方法： 1.RT-PCR扩增AHSG基因:提取HepG2细胞总RNA,逆转录cDNA,以cDNA为模板,设计特异性引物,加入限制性酶切位点,扩增目的基因。 2.构建重组表达质粒及鉴定:将AHSG基因与pMD-18T载体连接,构建重组克隆质粒(AHSG-T),将重组克隆质粒转化到大肠杆菌DH5a细胞中,通过酶切鉴定、特异PCR鉴定和测序确定克隆质粒的正确性；用限制性内切酶将目的基因从克隆质粒上切下,再与表达质粒pET-30a(+)连接,构建重组表达质粒pET30a-AHSG,并将其转化到大肠杆菌DH5a细胞中,通过酶切及特异PCR扩增的方法鉴定重组表达质粒构建的正确性。 3.将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21中,构建原核表达系统BL21(pET30a-AHSG)。 4.确定最佳诱导条件:确定重组蛋白AHSG表达所需的最佳IPTG诱导浓度和最佳诱导时间。 5.可溶性分析:大量诱导AHSG重组蛋白表达,通过可溶性分析确定AHSG重组蛋白的主要表达形式,优化诱导条件增加可溶性蛋白的表达量。 6.蛋白纯化:通过镍离子亲和层析的方法纯化带有组氨酸标签的重组蛋白,并测定纯化蛋白的浓度,用Western blot鉴定重组蛋白。 7.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测原发性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中的AHSG抗体,比较其在原发性肝癌患者、慢性肝病患者和正常人血清中的水平。 8.以正常人血清中AHSG抗体含量的百分位数P95作为截断值,计算肝癌组、慢性肝病组和正常组AHSG抗体阳性率,用筛检试验的评价方法评价AHSG检测原发性肝癌的诊断价值。 9.并联14种肿瘤相关抗原(AHSG、Calnuc、CyclinE、CDK2、cIAP、RalA、p62、p53、CyclinB1、Koc、Impl、survivin、p16、C-myc)对原发性肝癌进行诊断,筛选并评价诊断原发性肝癌的最佳组合。 结果： 成功构建AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG)；最佳诱导条件为0.08mmol/L,IPTG诱导3h；可溶性分析显示目的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在；5mol/L尿素洗涤包涵体的效果最佳；通过镍离子亲和层析的方法纯化到AHSG重组蛋白,并经蛋白免疫印迹杂交确定了纯化蛋白的正确性。 ELISA结果显示,原发性肝癌患者血清中AHSG抗体水平高于慢性肝病患者和正常人,AHSG检测原发性肝癌患者的灵敏度仅为13.1％,诊断价值较低。并联9种TAAs可使检测的灵敏度提高到89.8％,特异度为86.8％。9种抗原联合检测的阳性预测值为86.3％,阳性似然比为6.80,阴性预测值为90.2％,阴性似然比为0.12。这些指标说明联合检测的诊断价值较高,具有较高的临床诊断价值。Kappa值为0.76,则说明该试验的检测结果与真实值中度一致。 结论： 成功构建AHSG基因原核表达系统和蛋白纯化系统,并获得纯化的重组蛋白AHSG；AHSG抗体在原发性肝癌患者血清中含量增加,是肝癌的一种血清标志物；单独检测原发性肝癌时,诊断价值较低,并联9种TAAs(CyclinE,cIAP,CyclinB1,p53,p62,Calnuc,Koc与Imp1)检测可能对原发性肝癌的诊断具有较高的应用价值。 收起