摘要: 间充质干细胞属于一种多能干细胞,其不但可以分化成多个胚层组织细胞,而且还具有显著的免疫调节特性,因此,无疑成为组织工程和治疗免疫因素介导疾病的良好工具。骨髓虽然是间充质干细胞最常见来源,但取材复杂,获取困难。国内外众多学者已在成体的多种... 展开 间充质干细胞属于一种多能干细胞,其不但可以分化成多个胚层组织细胞,而且还具有显著的免疫调节特性,因此,无疑成为组织工程和治疗免疫因素介导疾病的良好工具。骨髓虽然是间充质干细胞最常见来源,但取材复杂,获取困难。国内外众多学者已在成体的多种组织中分离出类似骨髓源间充质干细胞的细胞亚群。脂肪组织作为最容易获得的成体组织,可能成为最具吸引力、能够分离间充质干细胞的备选组织之一。 本研究的第一部分旨在研究成体脂肪组织中是否和骨髓一样也存在具有多能性的间充质干细胞。我们通过运用免疫磁珠分选和极限稀释的方法,从成体脂肪组织中分离得到-Flk1+CD31-CD34-的多能干细胞的亚群,诱导分化实验显示,该细胞在单细胞水平上体外可以向脂肪细胞、成骨细胞及肝上皮样细胞定向分化。免疫表型分析的结果显示,这些细胞高表达Flk1、CD105、CD44及CD29,但不表达vWF、CD31、CD34、CD45、CD11a、CD11b、CD117、HLA-ABC及HLA-DR。这与骨髓来源的Flk1+CD31-CD34-成体干细胞的表型基本一致；瑞氏-吉姆萨染色后可见,脂肪来源的干细胞,形态上也基本与骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干细胞相似,呈成纤维样；在对数生长期,细胞倍增时间与骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干细胞也基本一致,约为28小时。另外,我们的结果同时也提示,与骨髓源干细胞的分离纯化相比,从同一体积的脂肪组织分离得到的成纤维样集落细胞的数量是骨髓的10倍以上。既然骨髓源Flk1+CD31-CD34-细胞和脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞具有相同的功能,成体脂肪组织就应该更具应用前景。 第二部分旨在探讨体外定向诱导成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化的可能性。首先将成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、bFGF及EGF等因子的培养基中进行诱导,接着更换诱导培养基,采用含有适当浓度的β细胞调节素、尼克酰胺等高糖无血清培养基诱导细胞向胰岛样细胞分化,然后用RT-PCR法检测诱导前后nestin,ngn3,IPF-1,胰岛素,胰高血糖素基因的表达；用免疫组织化学法检测诱导前后nestin,胰岛素,胰高血糖素蛋白的表达；放射免疫分析法检测诱导前后细胞分泌胰岛素情况。结果发现:成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞经过第一阶段诱导后可分化成nestin阳性的祖细胞,再继续诱导6d后变圆的细胞逐渐增多,且聚集成团,免疫荧光实验证明经过这两个阶段诱导后的细胞能够表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素,放免分析结果表明诱导的胰岛样细胞团能够分泌胰岛素。因此,成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞具有胰腺干祖细胞的固有特征,极有可能作为种子细胞用于糖尿病的细胞治疗。 本论文的第三部分旨在探索成体脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞作为滋养层能否促进造血细胞的增殖、分化,以及体内脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞能否促进机体造血功能恢复。以脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞为滋养层,接种造血细胞,观察细胞数及CFLJ-GM的变化。将脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞通过尾静脉输给预先经137Cs全身照射0.35Gy的雌性C57BL/6小鼠,定期检测外周血和骨髓细胞的总数以及CFU-GM变化。体外实验的结果提示:实验组造血细胞总数及CFUJ-GM值在第2周即明显的高于对照组,脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞能够有效地支持造血细胞增殖及分化达6厨；体内实验结果提示:联合输注脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞的实验组小鼠,其外周血和股骨有核细胞数、CFLJ-GM值于第2周即明显的高于单纯照射组小鼠,第4周实验组小鼠部分骨髓细胞有Y染色体的表达,提示在受体内有供体细胞存在。因此,脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞能够促进照射小鼠的造血恢复。 本论文的第四部分探讨器官移植中脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞诱导免疫耐受的可能性。以CM-DM荧光染料示踪脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞在体内的分布情况,并以PCR的方法检测Y染色体的存在以进一步鉴定；以皮肤移植实验观察脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞移植组小鼠对供者来源组织器官移植物的反应性。结果发现:脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞可以进入并较长期(30天)存在于异基因小鼠的免疫器官内:在细胞移植组小鼠脾脏中可检测到供者来源的T细胞占受者脾脏细胞的6.68％；脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞移植组的小鼠供者来源皮肤移植物存活>90d,未处理组平均为10d。因此,异基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞移植后可形成稳定的嵌和体,并诱导特异性的免疫耐受产生。 本论文的第五部分,通过重建端粒酶活性延长脂肪源Flk1+CD31-CD34-干细胞的寿命,并对它的成骨潜能进行研究,以期为骨组织工程提供种子细胞。首先,将人端粒酶催化亚基(hTERt)基因通过脂质体转染法导入脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达,TRAP-PCR检测细胞端粒酶的活性。Von Kossa染色及RT-PCR检测已重建端粒酶活性的脂肪源干细胞向成骨细胞的分化潜能。结果发现:转染hTERT的脂肪源干细胞能够稳定地表达端粒酶活性。转染后传75代的细胞仍能维持着自我更新及向成骨细胞分化的潜能,且无恶性转化倾向。因此,我们的结果提示,重建端粒酶活性可延长脂肪源干细胞的寿命并能维持其自我更新及成骨潜能,从而为建立骨组织工程标准细胞系提供新的实验手段。 本论文的第六部分,对6例发生慢性肝脏GVHD的患者进入临床评估。患者在环孢霉素和糖皮质激素治疗无效后改用FK506治疗慢性肝脏GVHD,然而,若干天后,患者又出现了进行性肾功能受损,因此,停用FK506改用异基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞,相关生化检测指标显示,肝脏GVHD及肾功能受损很快得以缓解。现在,该6名患者生存状况良好。 本论文的第七部分旨在进一步评价成人脂肪源干细胞作为挽救方案用于对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病的治疗。6例对糖皮质激素耐药的Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病患者均经静脉输入成人脂肪源干细胞(剂量为1.0×106/kg),其中1例患者接受两次成人脂肪源干细胞的输注,其余5例患者均接受一次成人脂肪源干细胞治疗。在这6例患者中,2例患者接受的成人脂肪源干细胞来源于HLA配型完全相合的家庭供著,其余4例患者接受无血缘关系的无关供者的成人脂肪源干细胞。结果:所有接受成人脂肪源干细胞治疗的6例患者均无明显副作用出现；在接受成人脂肪源干细胞治疗的6例患者中,除1例患者(死于多器官功能衰竭)对治疗无反应外,另5例患者的病情(对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病)均很快得以缓解；对成人脂肪源干细胞治疗反应良好的5例患者中,其中有4例患者至今存活,中位生存时间40个月(18-90个月),目前仍处于血液学完全缓解状态且生存状况良好,另1人在接受成人脂肪源干细胞治疗13月后死于白血病复发。因此,成人脂肪源干细胞非常有希望用于治疗对糖皮质激素耐药的急性移植物抗宿主病。 收起