摘要: 氨基酸和葡萄糖转运载体表达与肌肉生长和肉质形成有十分密切的联系。氨基酸和葡萄糖转运载体转运的营养底物是骨骼肌生长发育的重要组成部分，品种、日龄、肌肉特性和营养等因素均可能使氨基酸和葡萄糖转运载体表达发生变化。为此，本论文开展了以下... 展开 氨基酸和葡萄糖转运载体表达与肌肉生长和肉质形成有十分密切的联系。氨基酸和葡萄糖转运载体转运的营养底物是骨骼肌生长发育的重要组成部分，品种、日龄、肌肉特性和营养等因素均可能使氨基酸和葡萄糖转运载体表达发生变化。为此，本论文开展了以下五个试验研究，旨在揭示猪骨骼肌部分氨基酸和葡萄糖转运载体发育性变化规律以及遗传因素和营养因素对其的影响，从而从分子水平探讨蓝塘猪和长白猪肌肉生长发育差异和乳酸菌对肉质产生影响的作用机制。 试验一猪葡萄糖转运载体GLUT-1的克隆 试验以6日龄健康长白猪骨骼肌为试验材料，成功克隆出猪葡萄糖转运载体GLUT-1基因cDNA的部分序列，其长度为792bp，与人和大鼠GLUT-1的cDNA序列比较发现同源性分别为92.7%和90.7%。 试验二猪氨基酸转运载体CAT-2和葡萄糖转运载体GLUT-4的分子克隆 试验采用RACE方法，根据GenBank中的公布序列或EST序列设计引物，以6日龄长白猪肌肉组织mRNA为模板，成功克隆猪氨基酸转运载体CAT-2和葡萄糖转运载体GLUT-4基因cDNA的全长序列。结果表明： (1)猪CAT-2cDNA全长3147bp，包含一个1974bp的ORF,5＇UTR(untranslatedregion)长85bp,3＇UTR长1087bp，编码657个氨基酸残基的蛋白质序列与碱性氨基酸转运家族SLC7A2基因有很高的同源性，其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、CAT-2B的同源性分别为91.3%、88.1%、92.1%和89.2%。跨膜区分析显示其有14个潜在的跨膜区，和其它物种的一致。 (2)猪GLUT-4cDNA全长2491bp，包含一个1530bp的ORF,5＇UTR长34bp,3＇UTR长927bp，和人、兔子以及牛的GLUT-4cDNA序列具有高度的同源性，尤其CDS区的同源性分别高达90.3%、90.3%和91.0%。CDS编码509个氨基酸，猪GLUT-4氨基酸序列与人、兔子以及小牛的GLUT-4氨基酸序列同源性分别为94.5%,95.1%和93.1%。跨膜区分析显示其有12个潜在的跨膜区，和其它物种的一致。 试验三猪葡萄糖转运载体GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA表达的组织特异性 采集初生杂交仔猪心、肝、肺、肠、肾、脑和骨骼肌肌肉组织样品，提取组织样品的总RNA并进行反转录；用实时荧光定量PCR方法，检测猪GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2在不同组织中的表达丰度。结果表明： (1)CAT-2在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达，而在心脏表达最高，其次是在肝、骨骼肌和肺，脑和肠道稍低，肾脏表达量最低。 (2)GLUT-1在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达，而在心脏表达最高，其次是在肝、肾和脑组织，骨骼肌和肠道稍低，肺组织表达量最低。 (2)GLUT-4在新生仔猪脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心都有一定的表达，而在心脏表达最高，其次是在肝、骨骼肌和脑组织，在肺、肾和肠道等组织的表达量较低。 试验四蓝塘和长白猪骨骼肌GLUT-1/4、IR和CAT-2 mRNA表达发育性变化比较 分别采集1、7、26、30、60、90和150日龄的蓝塘和长白两品种猪不同骨骼肌组织样品，采用实时荧光定量RT-PCR方法，检测猪GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA在不同骨骼肌中的表达模式。结果表明： (1)1～150d蓝塘和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌葡萄糖转运载体GLUT-1存在相似的发育变化规律，在1d时表达水平最高。60d时蓝塘猪半膜肌GLUT-1mRNA表达丰度高于同日龄长白猪(P＜0.10);150d时蓝塘猪半腱肌GLUT-1mRNA表达丰度显著高于同日龄长白猪(P＜0.05)。 (2)1～150d蓝塘和长白猪半膜肌和半腱肌GLUT-4mRNA相对表达丰度随日龄呈波形式变化，变化速度和程度存在品种差异。1d时蓝塘猪背最长肌GLUT-4mRNA表达丰度低于同日龄长白猪(P＜0.10)，而在60d时显著高于长白猪(P＜0.05)；在7d和60d时蓝塘猪半膜肌GLUT-4 mRNA表达丰度显著高于同日龄长白猪(P＜0.05);1d时蓝塘猪半腱肌GLUT-4 mRNA表达丰度显著低于同日龄长白猪(P＜0.05)，而在其它日龄时有高于同日龄长白猪的趋势，其中150d时蓝塘猪比长白猪高48.14%(P＜0.10)。 (3)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌胰岛素受体(IR)mRNA表达丰度在1d和30d时表现出较高水平，而在7d、60d、90d和150d时无明显差异；同日龄蓝塘和长白猪之间无显著性差异。 (4)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌CAT-2 mRNA表达水平从出生1d时开始逐渐上升，在90d时达到最大值，且显著高于其它日龄，随后表现出下降趋势。 试验五植物源性乳酸菌对长×大肥育猪骨骼肌葡萄糖和碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响 试验选用体重58kg左右的长×大二元杂交阉公猪54头，随机分为两个处理，即对照组(A组)和乳酸菌组（B组），每个处理3个重复，每个重复9头。于试验结束时从每个重复选取2头接近平均体重的阉公猪进行放血屠宰。宰后2h内，按解剖学位置分别从背最长肌胸腰结合处、半腱肌中段和腰大肌中段采取组织样品，采用实时荧光定量RT-PCR方法，检测猪GLUT-1/4及碱性氨基酸转运载体CAT-2mRNA在不同部位骨骼肌中的表达模式。结果表明： (1)猪日粮中添加植物源性乳酸菌，对背最长肌、半腱肌和腰大肌总糖原含量无显著影响，但有提高背最长肌PG含量趋势(P＜0.10)。 (2)在猪背最长肌、半腱肌和腰大肌中，以腰大肌GLUT-1/4和IR mRNA表达水平最高；猪日粮中添加植物源性乳酸菌，对背最长肌、半腱肌和腰大肌GLUT-1/4以及IR mRNA相对表达丰度无显著影响。 (3)猪日粮中添加植物源性乳酸菌，对猪背最长肌、半腱肌和腰大肌CAT-2mRNA表达丰度无显著影响，但有降低腰大肌CAT-2表达水平趋势。研究主要结论 (1)猪葡萄糖转运载体GLUT-1基因cDNA的部分序列，与人和大鼠同源性分别为92.7%和90.7%。猪CAT-2 cDNA与碱性氨基酸转运家族SLC7A2基因有很高的同源性，其和人CAT-2A、CAT-2B以及小鼠CAT-2A、CAT-2B的同源性达91.3%、88.1%、92.1%和89.2%。14个潜在的跨膜区，和其它物种的一致。猪GLUT-4cDNA和人、兔子以及牛的GLUT-4cDNA序列具有高度的同源性。12个潜在的跨膜区，和其它物种的一致。 (2)CAT-2 mRNA、 GLUT-1 mRNA和GLUT-4 mRNA均在新生仔猪心脏表达最高。 (3)蓝塘猪和长白猪背最长肌、半膜肌和半腱肌中GLUT-4 mRNA表达水平明显高于GLUT-1；长白猪骨骼肌CAT-2 mRNA表达量最大值出现在90～150日龄期间；蓝塘猪和长白猪三个部位骨骼肌GLUT-4 mRNA表达丰度高峰期均未表现出与IR一致。 (4)猪日粮中添加植物源性乳酸菌，以腰大肌GLUT-1/4和IR mRNA表达水平最高；同时有降低腰大肌CAT-2mRNA表达水平趋势。 收起