摘要: 研究背景： 慢性乙型肝炎病毒感染是全球性问题，在我国尤为突出。全球约有3.5亿HBV现症感染者，每年约有100万患者死于肝功能衰竭和HBV相关的原发性肝癌。慢性HBV感染的自然史一般可分为3个期，即免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。... 展开 研究背景： 慢性乙型肝炎病毒感染是全球性问题，在我国尤为突出。全球约有3.5亿HBV现症感染者，每年约有100万患者死于肝功能衰竭和HBV相关的原发性肝癌。慢性HBV感染的自然史一般可分为3个期，即免疫耐受期、免疫清除期和非活动或低(非)复制期。我国慢性HBV感染多数为母婴垂直传播或家庭内水平传播，因为婴幼儿时期免疫耐受而发展为慢性感染，并存在HBV DNA高复制情况；而在青少年和成人期感染HBV者中，仅5％～10％发展成慢性，一般无免疫耐受期，大部分感染者将实现HBV清除。慢性HBV感染免疫清除随着年龄增长而活跃，因此，青壮年常是慢性乙型肝炎活动的危险时期，部分患者将出现HBeAg/anti—HBe血清转换并伴随HBV的低水平复制，亦有部分患者发展成重型肝炎而肝衰竭死亡。长期反复的肝脏炎症、乙型肝炎病毒e抗原持续阳性和高HBV DNA载量是肝硬化和原发性肝癌的重要相关因素。 干扰素是机体抗病毒先天性免疫的重要细胞因子，也是目前抗HBV治疗的主要药物之一；寡聚腺苷酸合成酶是IFN发挥抗病毒作用的重要机制之一。人类OAS基因位于第12对染色体上，包括OAS1、OAS2、OAS3和OASL4个基因，前三者编码产物具有核苷转移酶活性，在双链RNA存在的情况可以催化三磷酸腺苷聚化成寡聚腺苷酸,2'—5'OA激活潜在性RNA内切酶降解病毒或细胞mRNA，从而抑制病毒转录、翻译并具有促进细胞凋亡的作用；OASL基因编码产物无核苷转移酶活性，功能未明。OAS1基因产物要组成四聚体才能发挥酶活性，而OAS2和OAS3基因产物的活性形势分别为二聚体和单体。OAS1基因由于外显子6和7之间剪接位置不同而编码一组不同的产物，各产物单体N—端具有相同的346个氨基酸，而C—端氨基酸序列长短相差较大。目前已有的研究表明OAS1基因上的SNP rs10774671等位基因与编码产物多样性相关，rs10774671和rs2660等多个SNP与该酶活性高低存在相关，从而影响内源性IFN在抗病毒先天性免疫中的功能，与许多病毒感染相关性疾病的易感性或转归有关。虽然HBV复制过程中并不存在dsRNA，但已有的研究显示慢性HBV感染者血中OAS酶活性均呈不同程度升高，且治疗前或治疗中OAS活性高则有利于慢性HBV感染者对IFN抗病毒治疗产生应答，其中原因未明。 单核苷酸多态性继限制性片段长度多态性和短串联重复序列之后成为第三代遗传标志，是个体差异的遗传学基础。当前检测SNP方法众多，其中竞争分化聚合酶链反应是基于等位基因PCR原理上改良的SNP基因型检测方法，适用于大批量SNP检测，具有高效、价廉、准确、省时和设备要求低的优点，有望成为SNP的临床检测方法。 OAS1基因SNP可造成编码产物的多态性和酶活性差异，这是否对慢性HBV感染者自发性HBeAg/anti—HBe血清转换产生影响？目前尚未见相关研究报道。因此本研究采用CD—PCR来检测OAS1基因SNP的基因型，了解其与慢性HBV感染者自发性HBeAg/anti—HBe血清转换以及抗原表达的关系。 研究目的： 长期反复的肝脏炎症、HBeAg持续阳性和高HBV DNA载量是肝硬化和原发性肝癌的重要相关因素。外源性IFN治疗表明其能够抑制HBV DNA的复制并促进HBeAg/anti—HBe血清转换，从而降低肝硬化和原发性肝癌的发生率。OAS—RNase L途径是IFN抗病毒的重要机制之一，OAS活性与OAS1基因上的SNP存在明显关系，因此本研究从OAS1基因上的两个SNP入手，探索其不同基因型对慢性HBV感染的自发性HBeAg/anti—HBe血清转换以及HBsAg和HBeAg两种抗原表达的影响，并探讨两SNP基因型检测是否可以成为外源性IFN抗HBV治疗的有效预测指标。 研究方法： 将入选的126例年龄介于9～29周岁的慢性HBV感染者按照乙肝两对半检测结果分为HBeAg阳性和anti—HBe阳性两组，所有病例在首次确诊慢性HBV感染后无接受抗HBV治疗或因为其他疾病而接受免疫抑制剂治疗的历史，亦无明确HCV、HDV或HIV感染史，anti—HBe阳性病例HBV DNA定量<1×105拷贝/毫升。 对采集到的血液标本进行人基因组DNA提取，对两SNP所在的目的DNA片段进行基础PCR扩增待检，克隆构建CD—PCR检测两SNP不同等位基因所需的阳性对照质粒DNA，利用阳性对照质粒DNA探索和优化CD—PCR基因型检测的引物配比和反应温度等参数，再用CD—PCR方法对两SNP所处的目的DNA扩增片段进行相应的竞争分化扩增，与相应SNP等位基因碱基正确配对的等位基因特异性引物将获得优势延伸，CD—PCR扩增的产物变性后与包被于微孔板上的特异性核酸探针进行杂交，加入辣根过氧化物酶标记的含anti—DIG和anti—FIFC的酶标液进行反应，洗板后最终加入含四甲基联苯胺的底物缓冲液进行显色，根据显色情况或酶标仪A值测定结果判断基因型，计算出基因型频率和等位基因频率，比较两组间的差异以分析两SNP不同基因型或等位基因对慢性HBV感染者自发性HBeAg/anti—HBe血清转换是否存在影响。 HBsAg和HBeAg两种抗原水平使用Abbott AXSYM自动检测系统进行检测，比较两组病例不同SNP基因型之间的抗原水平的差异，分析两SNP不同基因型对抗原表达的影响。 根据SNP基因型检测结果挑取6份标本进行克隆，每份标本随机挑取多个克隆菌落进行测序，以验证CD—PCR基因型检测的准确性。 研究结果： 所有患者血液标本提取基因组DNA后对目的DNA片段进行了扩增，经过2％琼脂糖凝胶电泳显示DNA提取和DNA扩增的成功率达100％，酶切电泳显示成功克隆构建了CD—PCR检测两SNP等位基因所需要的阳性对照质粒DNA，经过两竞争性引物配比调节和扩增反应参数优化，最终成功检测了各个标本两SNP的基因型，DNA克隆测序结果验证了本实验SNP基因型检测的准确性。 基因型检测结果：126名患者中，rs10774671基因型GG、GA和AA分别有8、43和75例，rs2660的基因型GG、GA和AA分别有9、40和77例，经过x2检验显示基因型检测结果符合Hardy—Weinberg遗传平衡定律，说明本研究样本具有群体代表性。同一标本中检测出两个SNP基因型同时为GG、GA、AA分别有7、37和73例，与单SNP基因型检出情况高度吻合，结合克隆测序结果可以认为两SNP等位基因存在连锁关系。 SNP rs10774671检测结果：在anti—HBe阳性组基因型GG、GA和AA分别为7、26和35例，等位基因G和A的频率分别为29.4％和70.6％；HBeAg阳性组基因型GG、GA和AA分别为1、17和40，等位基因G和A的频率分别为16.4％和83.6％。anti—HBe阳性组较HBeAg阳性组具有更高的GG+GA基因型频率和更高的G等位基因频率。基因型为GG、GA和AA的HBsAg血浆水平分别是162.24±34.04、152.15±39.34和151.67±35.37，基因型为GA和AA时HBeAg血浆水平分别是254.30±93.24和236.93±94.62。 SNP rs2660检测结果：在anti—HBe阳性组基因型GG、GA和AA分别为7(10.3％)、25(36.8％)和36(52.9％)，等位基因G和A的频率分别为28.7％和71.3％；HBeAg阳性组基因型GG、GA和AA分别为2(3.4％)、15(25.9％)和41(70.7％)，等位基因G和A的频率分别为16.4％和83.6％。anti—HBe阳性组较HBeAg阳性组具有更高的GG+GA基因型频率(OR=2.114，95％CI：1.024～4.490，P=0.042)和更高的G等位基因频率(OR=2.053，95％CI：1.108～3.802，P=0.021)。基因型为GG、GA和AA的HBsAg血浆水平分别是156.36±34.85、157.22±39.26和149.77±35.33(ANOVA分析，P=0.576)，基因型为GA和AA时HBeAg血浆水平分别是238.23±93.23和241.80±96.05(t检验，P=0.910)。 研究结论： 1) OAS1基因SNP rs10774671等位基因G和基因型GG或GA有利于慢性HBV感染者出现自发性HBeAg/anti—HBe血清转换，等位基因A和基因型AA则不利于自发性HBeAg/anti—HBe血清转换。 2) OAS1基因SNP rs2660的等位基因和基因型与慢性HBV感染者的自发性HBeAg/anti—HBe血清转换的关系与rs10774671相似。 3)两位点SNP不同基因型对于周围血HBsAg和HBeAg两种病毒抗原表达影响无差异。 4) OAS1基因两SNP rs10774671和rs2660均可作为慢性HBV感染者接受干扰素抗HBV疗效的预测指标；由于两位点SNP等位基因之间存在连锁关系，在实际应用中可只检测其中一个；而rs10774671与转录剪接相关，因此作为首选。 收起