摘要: 当今世界能源危机与环境污染日益严重，可再生清洁能源的开发和利用已得到世界范围的重视。氢能源的清洁可再生使得它成为未来的理想替代能源。生物制氢技术反应条件温和、能耗低，其中既能利用太阳能产氢又可净化处理有机废水的光合细菌制氢技术是一... 展开 当今世界能源危机与环境污染日益严重，可再生清洁能源的开发和利用已得到世界范围的重视。氢能源的清洁可再生使得它成为未来的理想替代能源。生物制氢技术反应条件温和、能耗低，其中既能利用太阳能产氢又可净化处理有机废水的光合细菌制氢技术是一种有效可行的绿色氢能生产技术。沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是目前国内外比较常用的光合产氢模式菌株。 本文从环境中分离纯化了2株沼泽红假单胞菌，通过基因改造构建出吸氢酶大亚基hupL基因缺失突变株，进行了野生菌株和突变菌株的生长及产氢特性研究，以期突变株氢气产量获得提高并为污水治理提供优良菌种资源。 研究结果如下： ①分离纯化鉴定，最终获得R.palustris专利菌株。分别从湖底及江边污泥取样，利用光合细菌富集培养基进行富集，再用分离培养基对已得菌株进行分离纯化，得到2株纯化菌株，通过生理生化与分子生物学方法鉴定，两菌株同为R.palustris，分别命名为R.palustris CQU01和R.palustris CQU02。16S rDNA分子鉴定结果显示二者分别与R.palustris strain：LW-RE和R.palustris strain：TUT3620有着97％和98％的相似度。 ②构建并鉴定了R.palustris hupL靶向性自杀载体。利用R.palustris CQU01作为出发菌株，PCR扩增hupL两侧的基因片段hupS、hupC作为双交换时的交换臂，连入pMD18-T载体进行测序验证，pSUP202载体上含有HindⅢ和SalⅠ酶切位点，通过HindⅢ和SalⅠ双酶切并回收大片段载体，将两目的基因扩增产物与大片段载体连接形成前自杀载体‘pSUP202-hupSC'。pUC4K载体通过$se8387I将Kmr cassette片段基因切下，前自杀载体同样使用Sse8387I切开，去磷酸化处理。将Kmr cassette片段连入前自杀载体，构建出pBPZ自杀载体。 ③构建并鉴定了沼泽红假单胞菌hupL缺失突变株。将自杀载体pBPZ转入E.coli S17-1，获得接合供体菌，将处于生长对数期的供体菌E.coli S17-1和出发菌(受体菌)R.palustris CQU01以1∶3的比例混合进行接合培养，pBPZ通过接合作用转入R.palustris CQU01。具有Km抗性的目的菌株在含抗生素的RCVBN平板上得以筛选。对阳性菌株进行传代20次，每隔2代进行一次PCR检测，以验证突变株稳定性。使用亚甲基兰显色法对突变菌株进行吸氢酶活性测定，结果得到的阳性突变株R.palustris CQU012稳定性较好，吸氢酶活性降低明显。 ④生长及产氢特性研究。分别对野生菌和突变菌的生长及产氢特性进行测定比较。两者生长特性无显著区别，突变菌R.palustris CQU012生长对数期稍长。另外突变菌产氢量有明显提高，R.palustris CQU01每1L培养物在216h内共产生约350ml氢气，而相同条件下R.palustris CQU012共产生约530ml氢气，总产氢量约提高50％。两菌株在216h后基本不产生氢气。 产氢量有较大提高、生长特性无明显差异以及遗传特性稳定的特点可望使该突变菌株产生应用价值，一方面为缓解能源危机提供氢气的生物来源，一方面为有机污水治理提供优良种质资源。 收起