摘要: 目的： 多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。本病多在成年早期发病，女性多于男性，大多数患者表现为反复发作的神经功能障碍。由于MS发病率较高... 展开 目的： 多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病。本病多在成年早期发病，女性多于男性，大多数患者表现为反复发作的神经功能障碍。由于MS发病率较高，呈慢性病程且青年人好发，因此成为重要的神经系统疾病之一。目前MS的发病机制尚不完全清楚，而且缺乏有效的防治措施，因此通过建立动物模型，探讨MS的发病机制，寻求有效的治疗方案，是我们目前研究的主要方向。 MS的发病涉及遗传、病毒、免疫、环境地理等，是多种因素共同致病的结果，其中免疫学因素在MS的发病中起着关键性作用。以前我们认为MS的发生是由IL-12诱导的Th1细胞所介导的，但是近几年随着与IL-23相关的且能够分泌IL-17的Th17细胞的发现和深入研究，人们发现介导这种自身免疫病发病的关键是IL-23/Th17轴而不是IL-12/Th1轴，这为探索MS的发病机制提供了新的思路和方向。 依达拉奉（Edaravone）注射液是国内近几年开发上市的一种新型的小分子自由基清除剂，易透过血脑屏障，其主要通过捕获羟自由基（·OH）抑制脂质过氧化作用、抑制脑细胞（血管内皮细胞、神经细胞）过氧化作用，从而减轻脑水肿和脑组织损伤，目前临床上主要用于缺血性脑血管病的治疗。近年来有学者发现依达拉奉可以抑制活化的小神经胶质细胞的活性氧簇（ROS）和一氧化氮（NO）的产生及iNOS mRNA的表达，并减轻小神经胶质细胞诱导的神经元死亡和树突毒性现象。活化的小神经胶质细胞被认为与炎症性脱髓鞘疾病的发病机理有关，因此提示依达拉奉对MS可能具有治疗价值。 本实验应用研究MS的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型，使用依达拉奉注射液给予干预，通过对实验动物的发病率，行为学改变，脊髓病理学变化以及血清中IL-17和IL-23表达水平的研究，探讨IL-23/Th17轴在。EAE发病机制中的作用以及依达拉奉的治疗作用和机制，为临床实践提供理论基础。 方法： 1、动物分组：将90只6-8周龄健康雌性Wistar大鼠，体重180-200g，随机分为正常对照组、EAE模型组、地塞米松（dexamethasone，DXM）组、依达拉奉小剂量组（3 mg·kg-1·d-1）、依达拉奉大剂量组（10 mg·kg-1·d-1），每组各18只。每组又随机分为7天、16天、23天三个亚组，每个亚组6只大鼠。 2、模型制备：将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆，加上完全福氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA），佐剂中所含卡介苗的剂量为6mg/ml，经过乳化后按0.5ml/只分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射。药物治疗组于模型制备第一天起给予相应剂量的药物腹腔注射，药物每天一次持续给至动物处死时为止。 3、神经功能评分：于动物免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察，并对动物进行神经功能评分，采用Kono等提出的评分标准：1分：动物尾部无力：2分：尾部无力+肢体无力；3分：肢体轻度麻痹；4分：肢体严重麻痹，被动翻身后不能复原；5分：濒死状态。 4、血清中IL-17和IL-23的测定：将实验动物于免疫后第7天、16天、23天时麻醉后心脏取血留取标本，室温静置1小时，低温离心留取血清，-20℃冰箱冻存待用。应用酶联免疫吸附方法（ELISA）对血清中IL-17和IL-23的浓度进行测定。 5、组织病理学：在动物麻醉状态下，快速取其大脑侧脑室周围及脊髓颈、胸、腰膨大处组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光学显微镜下观察炎症细胞的浸润情况。 结果： 1、动物发病率观察：依达拉奉大剂量组和DXM组大鼠的发病率均低于EAE组，差异有统计学意义（p<0.05）。依达拉奉小剂量组与EAE组大鼠之间的发病率差异没有统计学意义（p>0.05）。 2、行为学观察：各组大鼠在发病高峰期时神经功能评分比较，依达拉奉大剂量组、DXM组各大鼠神经功能评分明显低于EAE组（p<0.05）。依达拉奉小剂量组与EAE组之间神经功能评分差异没有统计学意义（p>0.05）。 3、组织病理学观察：在疾病初期，EAE组大鼠组织内即出现炎性细胞浸润，且炎性细胞数目的多少与疾病严重程度相一致。在发病高峰期，依达拉奉大剂量组、DXM组大鼠组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目明显低于EAE组及依达拉奉小剂量组（P<0.05）；依达拉奉大剂量组和DXM组，EAE组和依达拉奉小剂量组大鼠组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目差异没有统计学意义（p>0.05）。疾病缓解期各组大鼠组织内的血管袖套数目差异均没有统计学意义（p>0.05）。 4、血清中IL-17和IL-23的表达 4.1 IL-17：在疾病的潜伏期和高峰期，EAE组大鼠血清中IL-17的表达水平较正常对照组显著升高（p<0.05），而恢复期大鼠血清中IL-17的表达水平较正常对照组差异无统计学意义。在疾病各时期，各药物干预组大鼠血清中的IL-17表达水平较EAE组均有不同程度的降低，其中依达拉奉小剂量组大鼠血清中IL-17水平降低的更为明显。 4.2 IL-23：在疾病的高峰期，EAE组大鼠血清中IL-23的表达水平较正常对照组显著升高（p<0.05），在疾病的潜伏期和恢复期大鼠血清中的IL-23水平较正常对照组差异无统计学意义。在疾病各时期，各药物干预组大鼠血清中的IL-23表达水平较EAE组均有不同程度的降低。 结论： 1、EAE大鼠血清中IL-17和IL-23的表达与疾病的活动性有关。 2、依达拉奉可以降低EAE大鼠的发病率，减轻发病时神经功能损伤的程度。 3、依达拉奉可以减轻EAE大鼠大脑和脊髓内炎性细胞浸润的程度。 4、依达拉奉可以不同程度地降低EAE大鼠血清中IL-17和IL-23的表达水平。 5、依达拉奉与地塞米松比较，虽然地塞米松在发病率和神经功能评分上优于依达拉奉，但是依达拉奉可以避免长期应用地塞米松引起的严重不良反应，充分显示出应用安全和耐受性良好的优势。 收起