摘要: 宫颈癌是世界范围内常见的妇科恶性肿瘤，世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二。目前，宫颈癌的临床治疗主要以手术和放化疗为主，治疗效果不理想，不仅给病人带来了身心痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。研... 展开 宫颈癌是世界范围内常见的妇科恶性肿瘤，世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二。目前，宫颈癌的临床治疗主要以手术和放化疗为主，治疗效果不理想，不仅给病人带来了身心痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。研究表明，宫颈癌的发病和高危型人乳头瘤病毒（hign-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持续感染密切相关，因此，研制高效而经济的人乳头瘤病毒疫苗对于防治宫颈癌有着十分重要的意义。 人乳头瘤病毒有大约200种型别，根据与宫颈癌的发病关系，可以分为高危组和低危组，低危组包括6、11、42、42、44型，主要引起上皮疣病等良性病变；高危组包括16、18、31、33、34、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70型，主要导致宫颈癌及其他粘膜上皮癌变，其中，约80%宫颈癌的发生与4种亚型（16、18、31型和45型）的HPV感染有关，50%的宫颈癌与HPV16感染相关。因此，针对16型研制人乳头瘤病毒疫苗具有广泛的社会和经济价值。 宫颈癌的发病与高危型HPV的E6、E7基因的持续表达密切相关，其编码的HPV E6、E7蛋白持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的条件。高危型HPV E6蛋白与野生型肿瘤抑制蛋白P53具有高度亲和性，使P53快速降解，从而引起细胞无限增殖并向恶性转化。HPV E7蛋白通过结构上的pRb结合位点，优先与非磷酸化的pRb结合，从而使pRb-E2F复合物解离，游离的E2F发挥其转录因子的作用，转录细胞由G1期进入S期所需的基因，导致细胞周期调节失控、发生永生化。 目前，根据功能的不同，人乳头瘤病毒疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗；按类型，可分为基因疫苗、多肽和蛋白疫苗、载体疫苗、树突状细胞疫苗等。研究表明，HPV L1基因在真核及原核细胞表达系统中能自动组装成无HPVDNA的假病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），与真实病毒颗粒有着相似的结构和抗原表位，能够引起体内特异性中和抗体的产生而不具有致病性，因此能够作为预防HPV感染的靶抗原，阻止HPV的感染。 虽然目前已有人乳头瘤病毒疫苗相关产品问世，但是却存在价格高，不易被人们接受，难于推广或对人体有很大毒副作用等诸多问题。由郑文岭教授和马文丽教授首次提出的消化道基因治疗和基因免疫的理论为新型人乳头瘤病毒疫苗的研发提供了新的思路。肠道拥有近300 ㎡的粘膜表面，其中含有上皮内淋巴细胞及Peyer's集合淋巴滤泡（统称肠相关淋巴组织GALT）等丰富的免疫介导组织，这为消化道基因免疫提供了条件。抗原基因到达肠道后，可能被小肠上皮细胞或肠道M细胞吸收，进而表达出相应的抗原蛋白，提呈给肠道淋巴组织，产生相应抗体和免疫相关淋巴细胞反应。抗原基因也可能直接经肠上皮细胞间隙进入小肠细胞下层的抗原提呈细胞进而发挥作用。消化道基因疫苗以其低廉的成本、简便的制作、广泛被人们接受的口服方式等诸多优点成为新型疫苗研究的热点。 由于消化道的特殊结构，必须选用合适的载体将治疗基因或抗原基因运送至肠道。目前，应用于消化道基因治疗和基因免疫的载体有病毒载体、细菌载体及化学合成载体等，但是它们都具有转染效率不高及潜在不安全因素等问题。本课题所应用的酿酒酵母运送体系安全无毒，自身具有一定的免疫增强功能，操作简单，转入基因效率高，易于大规模培养发酵，且保存运输方便，经实验研究，可以应用于消化道基因治疗和基因免疫。 HIV-1 Tat是蛋白转导域成员之一，它能够将与其共价连接的多肽、蛋白及DNA分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率高且对细胞没有损伤。将Tat与目的基因融合表达于酿酒酵母体系，在消化道转基因的过程中，Tat将可能介导与之融合的目的基因或目的蛋白跨膜进入小肠上皮细胞、M细胞或肠道相关淋巴组织，增强消化道转基因效率，促进肠道上皮细胞对目的基因和目的蛋白的吸收，因而Tat具有在消化道基因治疗和基因免疫中联合应用的潜力。 本课题以具有广泛应用价值的人乳头瘤病毒16型为研究对象，研究内容有以下两部分： 第一部分：首先构建融合基因Tat-HPV16 L1的原核表达载体，以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因，与原核表达载体pET28a连接，重组质粒再与自主设计的蛋白转导功能片段Tat连接，经测序鉴定后转入表达菌株BL21，筛选出稳定表达菌株之后，扩大培养，IPTG进行诱导表达。实验结果表明，Tat-HPV16 L1在原核体系中成功表达，为应用于真核系统奠定了基础。 第二部分：构建融合基因Tat-HPV16 L1的真核表达载体，以pBR322-HPV16质粒为模板扩增L1基因，与酿酒酵母表达载体pYES2连接，重组质粒再与自主设计的蛋白转导功能片段Tat连接，经测序鉴定后转入酿酒酵母表达菌株INVScl，筛选稳定转入菌株，扩大培养，诱导表达Tat-HPV16L1融合蛋白。结果，融合基因Tat-HPV16L1测序结果与预期完全符合，经过半乳糖诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和western blotting分析，诱导表达成功。融合表达载体pYES2-Tat-HPV16L1的成功构建和表达为制备以酿酒酵母为运送载体的口服人乳头瘤病毒疫苗打下基础。 收起