摘要: 目的：构建维甲酸受体变异蛋白(NLS-RARα)的诱饵表达载体，为应用酵母双杂交系统筛选与NLS-RARα相互作用的蛋白建立实验基础；利用酵母双杂交技术筛选与NLS-RARα相互作用的蛋白质，为研究NLS-RARα的作用靶点及其生物学功能奠定基础。 方法：PCR扩增... 展开 目的：构建维甲酸受体变异蛋白(NLS-RARα)的诱饵表达载体，为应用酵母双杂交系统筛选与NLS-RARα相互作用的蛋白建立实验基础；利用酵母双杂交技术筛选与NLS-RARα相互作用的蛋白质，为研究NLS-RARα的作用靶点及其生物学功能奠定基础。 方法：PCR扩增NLS-RARα，克隆入诱饵载体pGBKT7中，将构建好的诱饵载体pGBKT7-NLS-RARα转化到酵母细胞AH109中，并利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达情况。同时检测诱饵蛋白有无毒性，渗漏和自激活作用；构建能在哺乳动物细胞表达的载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，经酶切鉴定正确后，共转染入HEK293细胞，利用免疫共沉淀技术验证它们之间的相互作用。 结果：成功扩增了NLS-RARα基因片断，并克隆入pGBKT7中，测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中，诱饵蛋白无毒性，无自激活和渗漏，Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白；构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl经酶切鉴定成功，转染HEK293细胞后，用抗HA多克隆抗体沉淀后，用抗Myc单克隆抗体检测，能检测到JTVl的表达。 结论：成功构建了NLS-RARα结合域的酵母诱饵表达载体，为进一步筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础；成功构建了pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTVl，在HEK293细胞表达后利用免疫共沉淀验证实了NLS-RARα和JTVl之间存在着相互作用。 收起