摘要: 动脉硬化(As)是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，它与脂蛋白代谢异常密切相关，而脂蛋白受体在血脂代谢中起关健的作用。 受体与配体的识别、结合是受体发挥生理功能的重要基础。极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)是低密度脂蛋白受体超家族的成员，广... 展开 动脉硬化(As)是威胁人类健康和生命的主要疾病之一，它与脂蛋白代谢异常密切相关，而脂蛋白受体在血脂代谢中起关健的作用。 受体与配体的识别、结合是受体发挥生理功能的重要基础。极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)是低密度脂蛋白受体超家族的成员，广泛参与脂质代谢、细胞迁移及信号转导作用。VLDL-R的配体结合结构域上含有8个富含半胱氨酸的重复序列（ligand binding repeats,LBR），被认为是与配体结合的部位。近来的研究进一步提示VLDL-R的配体结合结构域中LBR1-3含有与配体识别、结合的关健位点。本研究的目的是用基因工程手段云获得小分子VLDL受体片段并将融合蛋白免疫新西兰兔以获得相应多克隆抗体，为进一步研究受体的功能奠定基础。 在实验中，我们以全长VLDL-R　cDNA为模板，利用PCR扩增获得LBR1-3和1-8的DNA片段并将其分别克隆至Pet-28a(+),CaCl2法转化大肠杆菌Rosetta(DE3),利用IPTG诱导蛋白表达并对表达条件进行优化，利用载体pET-28a(+)上的6个His标签使得表达产物经Ni+-NTA亲和层析树脂纯化并由Western Blot验证。将纯化的融合蛋白LBR1-3和LBR 1-8免疫新西兰兔，制备抗血清并用间接ELISA方法检测抗血清的效价。 实验结果显示首先成功克隆了LBR1-3和LBR 1-8的DNA片段，其次构建了pET-28a(+)-LBR1-3和pET-28a(+)-LBR 1-8重组质粒，并在大甩杆菌Rosetta(DE3)中得以表达并确定了最侍条件即：LBR1-3在IPTG浓度0.4mmol/L，诱导时间16h,诱导温度30℃的条件下，表达量最高；而LBR1-8在IPTG浓度0.6 mmol/L，诱导时间4 h，诱导温度30℃的条件下，表达量最高。融合蛋白LBR1-3和LBR1-8经Ni+-NTA亲和层析树脂得以纯化并制备了其多克隆抗体，间接ELISA方法检测效价分别为为1：10000和1：100000。 本研究通过构建pET-28a(+)-LBR 1-3和pET-28a(+)-LBR 1-8，获得了融合表达的国LBR1-3和LBR1-8蛋白。由于LBR 1-3和LBR 1-8融合蛋白具有免疫原性，因此通过将其免疫新西兰免制备了多克隆抗体。融合蛋白LBR 1-3和LBR 1-8的获得以及其多克隆抗体的制备为VLDL-R的进一步功能与应用研究奠定了基础。 收起