摘要: 马铃薯病毒对马铃薯的产量和质量影响严重。血清学方法是进行植物病毒检测及种类鉴定的重要方法。应用提纯病毒粒子作为抗原制备抗血清的传统方法存在一定缺陷，如病毒含量相对较低、提纯较困难，所得抗血清中常含有寄主杂蛋白的抗体等。将病毒cp基因... 展开 马铃薯病毒对马铃薯的产量和质量影响严重。血清学方法是进行植物病毒检测及种类鉴定的重要方法。应用提纯病毒粒子作为抗原制备抗血清的传统方法存在一定缺陷，如病毒含量相对较低、提纯较困难，所得抗血清中常含有寄主杂蛋白的抗体等。将病毒cp基因通过基因工程技术在原核细胞中高效表达，以表达产物作为抗原免疫健康家兔制备抗血清，可以解决传统方法的不足之处得到高效价及高特异性的多克隆抗体。 本研究通过克隆云南马铃薯主要病毒马铃薯S病毒(PVS)及马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白cp基因并构建其原核表达载体，使其在大肠杆菌中高效表达，用表达的融合蛋白作为抗原制备多克隆抗体，组装制备PVS及PLRV的ELISA检测试剂盒并应用于马铃薯病毒病的检测及其分布情况的调查。 (1)根据PVS、PLRV的cp基因全序列，设计cp基因两端含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的扩增引物，经RT-PCR扩增、克隆、测序，结果表明插入片段大小分别为885 bp及627 bp，BLAST分析为PVS及PLRV cp基因全序列。将其克隆到表达载体上，得到原核表达载体pET-30a-PVS cp和pET-28a-PLRV cp。 (2)将两个重组质粒转化到表达菌株BL21中，通过IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测，结果表明两种病毒均得到高效表达的融合蛋白，其两个表达产物均以不可溶的蛋白包涵体形式存在，用Ni2+-NTA亲和层析柱对其进行纯化，经透析后分析，浓度分别为3.96 mg/mL和2.72 mg/mL，纯度分别是93％和97％。 (3)将两种病毒的cp基因表达蛋白免疫健康家兔，制备了PVS和PLRV的抗血清，检测效价PVS抗血清为1∶51200; PLRV抗血清为1∶25600，经灵敏度、专化性及Western blot检测表明，制备的两种抗血清均具有高特异性。 (4)应用PVS和PLRV高特异性及高效价的抗血清组装制备灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒病检测试剂盒，采用ID-ELISA方法，对云南省马铃薯种薯种苗期病毒病提供检测技术服务及调查了解云南马铃薯病毒病的分布情况，该试剂盒的研制对于PVS和PLRV病害防控的研究也具有重要意义。 收起