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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 第一章探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法 目的:通过原代培养新生大鼠视皮层神经元,探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法,提高原代培养神经元的纯度及活性,为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。 方法:取出生后1~3d清洁级S... 展开 第一章探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法 目的:通过原代培养新生大鼠视皮层神经元,探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法,提高原代培养神经元的纯度及活性,为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。 方法:取出生后1~3d清洁级SD大鼠,定位视皮层,以酶消化法分离视皮层神经元,应用含10%新生牛血清、10%F-12 NutrientMixtures的DMEM培养基进行接种培养,含2%B-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养。利用尼氏染色进行神经元鉴定。 结果:接种1h后大部分细胞已贴壁。2~3h后见少数细胞长出较短的突起。24h后长出突起的神经元数目逐渐增多,突起长度增加。10d后神经元突起长度可达自身胞体直径的10倍以上,并形成复杂的网络结构。15~16d后神经元开始发生退化。镜下非神经元细胞形态与神经元存在差别并易区分。6d后非神经元细胞逐渐减少。神经元经尼氏染色后胞浆呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状,结构清晰。非神经元细胞胞浆基本不着色,胞核淡紫色圆形,核仁清晰可辨。神经元比例为40%~50%。 结论: 1.培养视皮层神经元生长良好,活性佳,易与非神经元细胞鉴别。 2.尼氏染色显示培养神经元比例约为40%~50%。 第二章培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸激活电流的特点 目的:探讨培养大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)-激活电流的特点。 方法:选择培养第11~14d形态典型、状态良好的视皮层神经元,应用膜片钳技术以全细胞模式记录其GABA-激活电流(IGABA)。 结果: 1.大部分受检细胞(85.42%,41/48)对GABA敏感。同一细胞IGABA幅值与GABA浓度呈剂量依赖关系:随浓度增大IGABA幅值逐渐增大。不同细胞上予以相同浓度的GABA,IGABA幅值不同。 2.IGASA具有明显的去敏感现象,应用双刺激法检测IGABA的去敏感时程,发现GABAA受体的去敏感恢复时间为5min。 3.IGABA可被GABAA受体的选择性拮抗剂荷包牡丹碱阻断,可被特异性GABAA受体激动剂蝇覃醇(Muscimol)模拟。 4.IGABA反转电位为0mV左右,接近CI-平衡电位。 5.IGABA幅值稳定,比较各时间点(0~30min)测得的变化率,差异无显著性。将各时间点的结果总和得到IGABA平均变化率为4.51±3.02%。 结论: 1.大部分培养大鼠视皮层神经元对GABA敏感。 2.IGABA具有剂量依赖性及明显的去敏感现象。 3.IGABA幅值稳定,平均变化率为4.51±3.02%。 第三章多巴胺对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用 目的:探讨多巴胺(Dopamine,DA)对培养大鼠视皮层神经元GABA-激活电流的作用。 方法:选择培养第11-14d形态典型、状态良好的视皮层神经元,应用膜片钳技术以全细胞模式记录IGABA。在不同时间点于细胞外液中分别加入不同浓度的DA、D1受体选择性激动剂SKF38393、D2受体选择性激动剂Quinpirole,联合应用SKF38393与D1受体拮抗剂SCH23390、SKF38393与Quinpirole观察IGABA的变化。 结果: 1.IGABA对DA存在剂量及时间依赖效应。预加DA可减小IGABA,加入10μM~500μMDA后,ICABA的变化率与对照组相比差异有显著性,其中50μM的剂量产生的作用最为显著。DA作用2~6min后,IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。 2.IGABA对D1受体选择性激动剂SKF38393存在剂量及时间依赖效应。预加SKF38393可减小IGABA,加入1μM~100μM SKF38393后,IGABA的变化率与对照组相比差异有显著性,剂量超过10μM后作用基本趋于稳定。10μM SKF38393作用3~6min后与对照组相比差异有显著性。抑制作用一般在预加4min后达到稳定。应用D1受体拮抗剂SCH23390(10μM)可显著减小SKF38393(10μM)对IGABA的抑制作用,差异有显著性。 3.单独应用10μM、100μM、1mM D2受体选择性激动剂Quinpirole 5min、10min后对IGABA无明显作用。 4.与单独应用SKF38393(10μM)相比,联合应用SKF38393(10μM)及Quinpirole(10μM)4~6min后对IGABA的抑制作用减弱,在5min组差异有显著性。 结论: 1.IGABA可被DA、D1受体选择性激动剂SKF38393抑制,其抑制程度与二者存在剂量及时间依赖性。D1受体拮抗剂SCH23390可显著减小SKF38393对IGABA的抑制作用。 2.单独应用D2受体选择性激动剂Quinpirole对IGABA无明显作用。 3.SKF38393及Quinpirole联合应用对IGABA的抑制作用较单独应用SKF38393减弱。 收起
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