摘要: 目的:建立RNA转染的HCV Subgenomic Replicon(HCV亚基因复制子)稳定转染和表达的细胞株；探讨CTE-核酶对丙型肝炎病毒亚基因组RNA复制的影响。 研究方法: 1.在T7体外转录RNA试剂盒介导下，将含有HCVSubgenomic Replicon的质粒pHCV BM4-5转化为R... 展开 目的:建立RNA转染的HCV Subgenomic Replicon(HCV亚基因复制子)稳定转染和表达的细胞株；探讨CTE-核酶对丙型肝炎病毒亚基因组RNA复制的影响。 研究方法: 1.在T7体外转录RNA试剂盒介导下，将含有HCVSubgenomic Replicon的质粒pHCV BM4-5转化为RNA。 2.建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamineTM2000介导下，将含有HCV Subgenomic Replicon的RNA导入人肝癌细胞系QSG7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法证实HCV Subgenomic Replicon RNA复制及其蛋白表达。 3.观察普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和CTE-核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子QSG7701。48小时后收集细胞，提取细胞总RNA，采用RT-PCR方法，观察核酶对HCV5’-NCR切割效果。 结果: 1.经RT-PCR和Western Blot证实，成功建立HCV SubgenomicReplicon RNA稳定转染QSG7701细胞株。 2.经RT-PCR证实：pPHCV5-CR1转染组未见明显HCV5’-NCR扩增目的条带，pPHCV5-R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组；pPHCV5-CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组，pPHCV5-R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组接近。这些结果提示：CTE-核酶在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点,CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。 结论: 1.成功建立HCV Subgenomic Replicon QSG7701细胞株。 2.CTE-核酶在细胞内切割HCVRNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点,CTE-核酶也能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。 收起