摘要: 肌肉生长抑制素(Myostatin)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一，又名为生长／分化因子-8(GDF-8)。Myostatin是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白，其作用特征是对肌肉生长有负调控作用，myostatin基因自然突变导致其生物活性的改变可以引起肌肉重... 展开 肌肉生长抑制素(Myostatin)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员之一，又名为生长／分化因子-8(GDF-8)。Myostatin是在骨骼肌中广泛表达的一类糖蛋白，其作用特征是对肌肉生长有负调控作用，myostatin基因自然突变导致其生物活性的改变可以引起肌肉重量的显著增加。 瘦素蛋白(Leptin)是由脂肪组织合成的一种重要肽类激素。通过与细胞膜上的长型受体结合，leptin启动了胞内一系列的信号转导系统，将身体能量贮存水平信号传送至大脑，从而对能量摄入与消耗进行调节。 参照GenBank发表的猪myostatin和leptin基因序列，分别设计两对特异性引物，以广西巴马小型猪肌肉组织和脂肪组织的总RNA为模板，通过反向聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出相应的cDNA片段。扩增片段纯化后，连接到pMD18-T载体，转入DH5α细菌扩增并测序。结果表明：扩增的myostatin基因序列为1128bp，leptin成熟肽基因序列为441bp，包含了各自成熟肽序列。同源性比较显示，广西巴马小型猪myostatin和leptin基因与GenBank报道的猪的相应基因序列的同源性分别达到99.7％和99.1％。 将克隆得到的myostatin和leptin基因序列，分别加入BamHI和EcoRI、BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，定向连接到原核表达载体pRSETA质粒上，构建pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS。经SDS-PAGE和western Blotting分析，本研究成功地表达了myostatin和leptin的融合蛋白。表达蛋白经1 mmol/L IPTG诱导7h(myostatin)或4h(leptin)表达量达到最高，并以包涵体的形式存在。将pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin重组菌进行大量表达后，包涵体用6mol/L的盐酸胍变性，可溶部分在50％Ni-NTA树脂上过柱纯化，通过透析使蛋白质复性，得到较纯的MSNT75和leptin融合蛋白。利用纯化得到的融合蛋白制备了MSNT75和leptin融合蛋白油乳剂疫苗。 本研究应用广西巴马小型猪myostatin成熟肽重组融合蛋白疫苗主动免疫小鼠、广西巴马小型猪和鸡后，实验组和对照组相比，其平均体重和平均增重都有下降的趋势，但差异不显著(P>0.05)，体内并未检测到相应的抗体。用广西巴马小型猪leptin成熟肽重组融合蛋白疫苗主动免疫小鼠后，小鼠的体重没有显著变化(P>0.05)，但实验组采食量显著低于对照组(P<0.05)。 综上所述，本研究克隆了myostatin和leptin基因，成功表达了其成熟肽融合蛋白，制作了融合蛋白油乳剂疫苗，进行初步的动物免疫实验，所获得的结果为进一步研究myostatin和leptin基因的生物学功能及为myostatin和leptin基因在生产实践上的应用奠定了基础。 收起