摘要: 主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)指集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群。其功能不仅限于移植排斥反应，它还与机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。近年来，基于MHC基因在器官移植和... 展开 主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)指集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群。其功能不仅限于移植排斥反应，它还与机体对外源性抗原的免疫应答之间存在关联。近年来，基于MHC基因在器官移植和免疫应答上扮演的重要角色，人们在人、鼠、绵羊、牛、犬等物种上进行了大量的研究。猪SLA-DOB基因是参与SLAⅡ类抗原递呈的一个重要功能基因，但在国内暂没有看到对该基因的相关研究报道。有鉴于此，本文以巴马小型猪、五指山小型猪、滇南小耳猪、合作猪、甘孜藏猪、荷包猪六个品种共137头猪的耳组织样以及一头巴马小型猪的内脏器官为材料，运用生物信息学手段、RT-PCR、原核表达及SSCP-PCR结合测序等方法对SLA-DOB基因进行了研究，主要包括对该基因序列的获取、特性分析预测、组织表达及多态性等方面，为猪免疫应答抗原递呈和相关基因多态性信息的后续研究提供一些有益的参考。主要研究结果如下： 1.以人HLA-DOB基因cDNA序列为信息探针，对猪EST数据库进行同源检索筛选，克隆了猪SLA-DOB1基因的cDNA序列，片段全长897bp。通过NCBI的ORFfinder服务器对所获得的cDNA序列进行开放阅读框架(ORF)分析，结果发现其开放阅读框架推测编码277个氨基酸。为了验证电子克隆序列的正确性，在其起始密码子区域和终止密码区域设计特异引物，经RT-PCR进行克隆、序列分析验证，结果表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为DQ333334)。通过序列同源比对及系统发育进化分析，发现克隆到的序列与其它物种DOB基因具有很高的同源性。应用生物信息学的方法对SLA-DOB1基因编码氨基酸进行蛋白质基本性质、结构及功能预测，结果显示SLA-DOB1分子是一种具有信号肽序列，靠近N端末端存在一个跨膜结构的MHCⅡ类β分子前体蛋白。多序列同源比对发现，SLA-DOB1与小鼠、牛、兔子、绵羊、犬、黑猩猩、人的DOB核酸序列的同源性分别为71％、77％、69％、79％、76％、77％、78％；与小鼠、牛、绵羊、犬、黑猩猩、人的DOB氨基酸序列的同源性分别为67％、76％、80％、78％、67％、76％。构建SLA-DOB1基因的分子进化树进一步揭示了猪与其它哺乳动物的进化关系。 2.本研究构建了SLA-DOB1基因全编码序列的原核表达质粒，并进行了表达研究。将克隆在pMD18-T载体上的SLA-DOB1基因全编码序列(834bp)插入原核表达载体pMAL-C2X，得到重组质粒pMAL-C2X-DOB1，转化大肠杆菌TB1(表达菌株)，IPTG诱导裂解菌体作SDS-PAGE分析，粗略得到融合表达蛋白特异条带，该表达条带的大小为75.8KDa(SLA-DOB1蛋白质为32.3KDa，菌蛋白为42.5KDa)。 3.巢式PCR检测SLA-DOB1基因在心、肝、脾、回肠、肾、胸腺、淋巴结中表达。其中，该基因在脾脏、胸腺以及淋巴结中高度表达，其次在心脏、回肠、肾脏和肝脏中有表达，而在肌肉中没有任何表达。 4.通过比对出的外显子区域设计了三对引物扩增出SLA-DOB的内含子1、2、3三个DNA片段，长度分别为571bp、663bp和804bp。根据内含子序列又设计了两对引物扩增出SLA-DOB的外显子2、3区域，长度分别为291bp和334bp。对DOB基因的外显子2、3通过SSCP的方法对6品种猪群共137个体进行了群体多态性研究，发现SLA-DOB第2外显子高度保守，而外显子3基于个体PCR-SSCP和菌落PCR-SSCP鉴别了10种等位基因，通过克隆测序发现，SLA-DOB基因有2个拷贝，一个为功能基因SLA-DOB1，一个为假基因SLA-DOB2。其中检测了SLA-DOB1的13个新等位基因，SLA-DOB2的3个新等位基因。SLA-DOB1基因第3外显子存在一定的程度的多态，基因多样性为0.897，核苷酸的多样性为0.00710。本研究还对SLA-DOB基于等位基因间和物种间进行了初步的系统进化分析和初步的命名。 收起