摘要: 第一部分骨髓间充质干细胞的多向分化潜能 第一章体fl,诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为5羟色胺敏感性神经元 目的：体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有神经元表型和部分功能的细胞。 方法：将取自6-8周成年SD大鼠股、胫骨的细胞... 展开 第一部分骨髓间充质干细胞的多向分化潜能 第一章体fl,诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为5羟色胺敏感性神经元 目的：体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有神经元表型和部分功能的细胞。 方法：将取自6-8周成年SD大鼠股、胫骨的细胞贴壁传代培养至6-10代，采用有限稀释法对细胞作单克隆纯化。在全反式视黄酸预诱导24小时后，HBSS洗去含血清培养液，换用改良的Woodbury长时程神经元诱导液培养细胞，3、6、9、12、24、48、72、96小时后显微镜下观察细胞形态变化；细胞免疫染色检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶、神经丝M+H、5-羟色胺的表达；并用胞内钙代谢测定法测定诱导前后细胞对5-HT的功能反应。 结果：改良神经元诱导液处理3小时后，细胞开始表现神经元的形态特征，细胞折光性增强，形成收缩的双极或多极胞体和细长突起。细胞可以维持神经元样存活72小时以上。诱导5小时后，对免疫染色的细胞用DAPI进行复染，92．4±6．9％的细胞表达神经元特异性烯醇化酶。诱导24小时后，93．9±5．2％的细胞表达成熟神经元的标志物神经微丝H。在给予5一羟色胺刺激时可以产生与神经元相似的胞内钙离子峰，且免疫组化证实5-羟色胺1A受体在干细胞上表达微弱，但在分化后的神经元中表达较强。 结论：本实验从形态、细胞标志物、功能几方面显示rMSCs可分化为5一羟色胺敏感性神经元。 第二章体外诱导成年大鼠骨髓干细胞分化为上皮样细胞 目的：将已成功诱导为5-HT敏感性神经元的单克隆rMSCs置于极性上皮细胞生长的渗透性滤膜上观察其向上皮细胞方向分化情况。 方法：取同一单克隆来源的rMSCs按照2×lO5个细胞／0．45cm2的密度种在漂浮在培养液上的渗透性滤膜上(常用于极性上皮细胞的培养)，置于37℃、5％C02的湿化孵箱中培养4天。将半透膜上细胞直接镜下观察或苏木素染色冰冻切片观察细胞形态变化；免疫荧光染色、RT-PCR、WesternBlotting检测细胞标志物在不同水平的表达情况；短路电流检测细胞的电生理特性。 结果：苏木素染色显示rMSCs在生长于渗透性滤膜上4天后形成了紧密的单层。免疫荧光染色显示此生长在渗透性滤膜上的单层细胞表达上皮细胞标志物细胞角蛋白5&8。RT-PCR结果也显示生长在渗透性滤膜而不是生长在培养瓶中的rMSCs表达上皮钠通道(ENaC)、囊性纤维跨膜转导调节子(CFTR)和紧密联结蛋白ZO—l的mRNA。但是，用WesternBlotting仅检测到ZO一1的表达。短路电流测定法显示生长在渗透性滤膜上的rMSCs来源细胞单层的电阻为30-50Ω，但对CFTR和ENaC的激动剂或阻断剂无反应。 结论：极性上皮细胞生长的培养条件能诱导rMSCs向上皮样细胞分化。这些上皮样细胞表现上皮细胞形态，表达部分上皮细胞标志物，但不具有成熟上皮细胞离子通道的功能。 第二部分rMSCs来源的神经元和上皮样细胞可以通过去分化和再分化途径相互转变 目的：首先从功能上证实rMSCs来源的神经元可以被诱导去分化、增殖和再分化，然后研究干细胞来源的神经元和上皮前体细胞能否在所建立的体外培养诱导条件下通过去分化再分化实现相互转变。 方法：在诱导rMSCs分化为神经元24小时后，换用含血清培养液，再过24小时后，按照2×lO5个细胞／0．45cm2的密度转移至渗透性滤膜上培养4天。然后将细胞刮下，转移至有含血清培养液的培养皿中，24小时后换为神经元预诱导液，一天后倾去预诱导液并用HBSS清洗细胞后加入改良神经元诱导液。继续培养24小时。镜下观察细胞形态改变，胞内钙代谢法检测细胞的功能改变。 结果：在rMSCs分化为神经元24小时后，换用含血清培养液培养24小时，所有的神经元表型的细胞均恢复rMSCs形态。去分化的细胞增殖24小时后按照诱导上皮细胞分化的浓度转移至渗透性滤膜上，4天后细胞形成紧密单层并可测得与直接由rMSCs形成的细胞单层相似的跨上皮电压、电阻和电流。将上皮样细胞从渗透性滤膜上刮下种在培养皿中的盖玻片上，单个散在的上皮样细胞可以被诱导去分化变为rMSCs形态后再分化为神经元，而成簇的上皮样细胞却不能被诱导去分化并再分化为神经元。 结论：结果提示成年大鼠骨髓干细胞来源的神经元和上皮前体细胞之间可以通过去分化和再分化实现互变。 收起