摘要: 脊柱源性下腰痛(lowbackpain)给患者和社会带来了沉重的负担，脊柱融合术至今仍是对经保守治疗无效的下腰痛患者所采取的一种标准治疗方法。近年来因椎间盘退变性疾病、腰椎不稳等原因接受脊柱融合手术的患者逐年增加，而其存在的问题也逐渐引起了人们... 展开 脊柱源性下腰痛(lowbackpain)给患者和社会带来了沉重的负担，脊柱融合术至今仍是对经保守治疗无效的下腰痛患者所采取的一种标准治疗方法。近年来因椎间盘退变性疾病、腰椎不稳等原因接受脊柱融合手术的患者逐年增加，而其存在的问题也逐渐引起了人们的重视。为了解决这些问题，人们进行了多方面的尝试，目前研究的重点逐渐集中在通过生物学方法改进骨移植材料方面。 基因治疗和组织工程的兴起给人们提供了一种全新的思路：将所需要的骨生长因子基因转入细胞，再复合生物支架材料构建组织工程骨，回植入体内成骨部位，靶细胞持续、高效表达生长因子，诱导成骨，进而达到促进脊柱融合的目的。我们希望在相关研究的基础上应用腺相关病毒(AAV)载体介导的病毒重组技术，将克隆的全长人BMP-4基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)，使其高效表达BMP-4，然后将其与生物支架材料——Ⅰ型胶原蛋白复合，构建一种全新的组织工程化骨。将其回植入新西兰兔脊柱后外侧，观察成骨及促进脊柱融合的情况。为探索基因治疗促进成骨和脊柱融合提供实验基础和理论依据。 本研究分为两部分进行： 第一部分：基础实验部分 目的：建立一种简单易行的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养及重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)构建的方法；观察AAV-hBMP4对BMSCs生物学行为的影响，为骨组织工程寻找理想的病毒载体及种子细胞。 方法： (1)BMSCs分离、培养及标记：采用全骨髓法分离培养BMSCs，诱导培养液诱导细胞成骨转化，行细胞形态学检查、细胞表面抗原鉴定、碱性磷酸酶(ALP)染色及VonKossa染色评价细胞成骨情况；在此基础上转染AAV-EGFP，初步探讨AAV载体对细胞的影响，观察细胞荧光表达的时间及强度，计算转染效率，MTT法描记细胞生长曲线，观察腺相关病毒载体(AAV)对细胞活性的影响。 (2)重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体(AAV-hBMP4)的构建：根据hBMP4的基因序列设计引物，上游引入EcoRI位点，下游引入SalI位点，以EX-A0242-M01-hBMP4为模板扩增目的基因。将hBMP4基因克隆入pUC18中，获得重组质粒pUC18-BMP4。EcoRI+SalI双酶切pUC18-BMP4及腺相关病毒通用质粒pSNAV，回收酶切片段，T4连接酶16°c过夜，转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞，筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP4，EcoRI+SalI双酶切鉴定，并行全基因测序。转染BHK21细胞，G418筛选培养，获得抗药克隆细胞株。HSV1-rc/△UL2感染，包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP4。 (3)AAV-hBMP4对兔BMSCs生物学行为及成骨活性的影响：根据AAV-EGFP转染的初步实验结果，将AAV-hBMP4按MOI值不同设定4组，分别转染兔BMSCs，观察病毒量对细胞形态的影响。选取影响最小的MOI值，进行后继实验。MTT法描记细胞生长曲线，观察AAV对细胞增殖活性的影响。以AAV-EGFP为参照，行流式细胞仪检测，计算转染效率。AAV-hBMP4与AAV-EGFP分别转染细胞，观察细胞形态，行ALP染色、VonKossa染色及ALP含量测定，观察成骨活性。 结果： (1)BMSCs分离、培养及标记：BMSCs扩增迅速、形态良好、纯度较高；经诱导后呈现明显的成骨改变；实验确定AAV以MOI值为1×105时转染细胞后，细胞转染效率可以达到90％；AAV转染后，细胞荧光持续高效稳定表达(＞8w)，并可随细胞有丝分裂传至子代，完全可以满足示踪标记的需要。 (2)AAV-hBMP4构建：PCR电泳及酶切鉴定表明pSNAV-hBMP4重组成功，基因测序显示装入PSNAV质粒中的hBMP4基因正确；DNA点杂交法示AAV-hBMP4病毒的滴度为1.5×1012vg/ml，分泌蛋白浓度约为0.124mg/ml，SDS-PAGEF法示病毒载体的纯度在95％以上。 (3)AAV-hBMP4对兔BMSCs生物学行为及成骨活性的影响：MOI为5×104vg/cell时，AAV对细胞形态影响最小，以此值进行后继实验。AAV转染后，细胞增殖活性良好，转染效率为55-65％。AAV-hBMP4转染后，细胞形态呈现典型的成骨改变，ALP染色及VonKossa染色均出现成骨改变，AAV-EGFP组无上述改变。细胞上清ALP含量测定，实验组ALP含量明显增高(t=2.179，p＜0.01)。 结论： 本实验采用的细胞培养、诱导的方法完全可以满足骨组织工程的需要；AAV长期稳定表达目的基因，是一种理想的组织工程病毒载体；基于基因转染方法高效稳定表达EGFP，可作为种子细胞良好的示踪标记方法。本实验获得的病毒载体滴度高、感染性好，完全可以满足骨组织工程的需要。AAV-hBMP4转染的BMSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。 第二部分：动物实验部分——新西兰兔脊柱融合实验 目的： 探讨基于转染人BMP4基因构建的组织工程化骨促进兔脊柱融合的能力，为自体骨寻找理想的移植替代材料。 方法： AAV-hBMP4及AAV-EGFP分别转染BMSCs后复合Ⅰ型胶原海绵构建组织工程化骨。采用新西兰兔后外侧L5/6脊柱融合模型，自身侧侧对照进行实验，14只实验动物分为随机2组，每组各7只，组①右侧植入复合转AAV-BMP4的BMSCs构建的组织工程化骨(BMP4组)，左侧植入自体骨对照(自体骨组)。组②右侧植入复合转AAV-BMP4的BMSCs构建的组织工程化骨(BMP4组)。左侧植入复合转染AAV-EGFP的BMSCs构建的组织工程化骨(EGFP组)。融合术后12w处死动物，分别行X线检查、三维CT检查、大体标本观察、手法扪诊检查及组织学检查评价成骨及脊柱融合情况。 结果： 术后2组各6只新西兰兔符合标准，进行评估。术后12wX线示12只实验动物中植入BMP4侧有11侧达到骨性愈合(11/12)，自体骨侧有5只达到骨性融合(5/6)。EGFP组仅有2侧达到骨性愈合(2/6)。三维CT及扪诊检查均得到相同的结果。大体标本观察BMP4侧及自体骨侧新生骨增生明显，成骨量大；EGFP侧成骨量明显少于BMP4侧。组织学检查可见BMP4侧新生骨质量良好。 结论： 人BMP4基因修饰的组织工程化骨是一种理想的自体骨组织替代物，在动物体内可以有效地促进成骨，提高脊柱融合率。人BMP4基因修饰的种子细胞(BMSCs)在体内能够高效表达BMP4因子，通过软骨化骨的方式诱导成骨。 收起