摘要: 黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，此外，在实际应用中还存在一些地方代用品与混淆品，河北省为黄芩主产区，同时大量分布有粘毛黄芩ScutellariaviscidulaBge.，并头黄芩ScutellariascordifoliaFischexSchrank，沙滩黄芩Sc... 展开 黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，此外，在实际应用中还存在一些地方代用品与混淆品，河北省为黄芩主产区，同时大量分布有粘毛黄芩ScutellariaviscidulaBge.，并头黄芩ScutellariascordifoliaFischexSchrank，沙滩黄芩ScutellariastrigillosaHemsl，北京黄芩ScutellariapekinensisMaxim等多种同属植物。近年来，主产地栽培黄芩逐步成为主要商品来源，但是，种子市场基源品种混乱，仅凭感官识别，同名异物、同物异名现象严重。几种黄芩属植物的种子在外部形态上非常相近，难以宏观鉴别，为确保黄芩药材质量的稳定可控，在规模化、规范化种植中首先要保证黄芩种源纯化、优良。本实验从外观性状、显微特征、理化性质等方面，并利用细胞生物学、分子生物学技术及超微技术对黄芩属几种植物的种子进行综合鉴别研究。既有快速、简便、实用、满足基层需要的方法又有新技术与传统中药鉴定技术交叉融合的深层次鉴别研究，也是我省制定中药种子标准前重要的应用基础研究。 一、性状、显微、理化鉴别 目的：应用快速、简便、实用的方法，建立黄芩、粘毛黄芩、沙滩黄芩、并头黄芩、北京黄芩种子的外观性状、显微特征、超微特征、理化性质方面的综合鉴别信息指征。 方法：1.外观性状观察。2.脱色表面片制备：(1)脱色：取种皮切成l-2mm小块浸入水合氯醛溶液中。(2)压片观察。3.石蜡横切片制备：(1)取材和固定：种子用蒸馏水4℃浸泡一周以上，F.A.A固定液固定一周以上。(2)脱水：依次用浓度为70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、无水乙醇进行脱水，每隔2-3h调换溶液。(3)透明：二甲苯一无水乙醇(1：1)浸种1h后，转入二甲苯中至种子透明为止。(4)浸蜡：65℃恒温箱中进行，半小时调蜡一次，至种子完全浸透。(5)包埋和切片：石蜡包埋，切片厚度12μm。(6)贴片和融蜡。(7)染色：番红一固绿双重染色。(8)脱水与封藏。4.种皮扫描电镜观察(1)清洗：取种子用50％乙醇超声清洗5min。(2)脱水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐级脱水，每一级脱水两次，每次30min，其间不断震荡清洗。(3)固定：戊二醛固定30min。(4)电镜观察：真空喷金后，进行观察。5.紫外扫描图谱特征：(1)取一定量黄芩、粘毛黄芩、沙滩黄芩和并头黄芩种子粉末用石油醚索氏提取3h，制备供试液A；挥干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3h，制备供试液B；然后挥干乙酸乙酯用甲醇索氏提取3h，制备供试液C。(2)扫描波长为200-400nm的紫外吸收图谱。(3)图谱分析。7.薄层色谱鉴别：(1)取一定量黄芩、粘毛黄芩、沙滩黄芩和并头黄芩种子粉末用石油醚索氏提取3h制备供试液D，供点样；另取种子粉末适量用70％乙醇超声提取制备供试液E。(2)点样，展开。(3)显色、观察、照相。 结果：1.宏观性状：五种种子均为近球形，黄芩和粘毛黄芩种子稍大，颜色为棕黑色，其余三种黄芩种子稍小，颜色稍浅，整体性状相似不易区分。2.脱色表面片：几种种子在内外表面细胞形状、细胞壁增厚和内含物方面有一定的区别。3.石蜡横切片：几种种子在表面凸起，果皮细胞层数、形状和表面角质层次级凸起特征上都有明显差别。4.扫描电镜观察：几种种子的次级凸起的微观特征明显差别。5.紫外扫描图谱：乙酸乙酯和甲醇提取部分的吸收峰数目和吸收峰位置有一定差别。7.薄层色谱：几种供试液黄芩、粘毛黄芩、沙滩黄芩和并头黄芩种子的薄层色谱有一定差别，可用于鉴别。 结论：黄芩及其同属植物的种子在外观性状、显微特征、理化性质存在差异，由此可以用于鉴别。方法快速、简便、实用，适用于几种种子的快速鉴别。 二、细胞生物学及分子生物学特征研究 目的：利用染色体组型分析、种子蛋白质PAGE技术及RAPD技术研究药用黄芩品种之间及黄芩属几种植物的综合鉴别信息指征，从细胞水平及分子水平鉴别真伪，并为黄芩的品种筛选提供依据。 方法：1.根尖体细胞染色体标本片制备：(1)预处理：种子25℃下萌发，根尖长1-2cm时切取，蒸馏水0-3℃处理24h。(2)固定：卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸3∶1)固定。(3)解离：95％乙醇∶浓盐酸(1∶1)解离5-10min。(4)后低渗：重蒸水低渗，时间8-15min。(5)染色：改良石炭酸品红液染色。(6)封片：冰冻揭盖片，中性树胶封片。(7)显微照相、计数、测量。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征研究：(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳：恒定电压120-180V。(4)染色和洗脱：考马斯亮蓝(R-250)染色，脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析：绘图并测定特征谱带泳动率。3.RAPD技术鉴别：(1)高盐低pH法提取纯化植物总DNA。 (2)PCR扩增及引物筛选。(3)图谱分析。 结果： 1.根尖体细胞染色体组型特征：黄芩染色体2n=18，染色体总长度48.9μm，平均长度2.7μm，变异倍数为2.05；粘毛黄芩染色体总数为2n=18，染色体总长度53μm，平均长度2.95μm，变异倍数为2.44。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征：黄芩、粘毛黄芩和沙滩黄芩种子的谱带数目和位置不同。黄芩图谱中一级带6条，二级带1条；粘毛黄芩图谱中一级带1条，二级带4条，三级带2条；沙滩黄芩图谱中一级带1条，二级带2条，三级带4条。几种黄芩之间有明显差别。 3.RAPD鉴别研究：筛选出可对黄芩、粘毛黄芩、沙滩黄芩进行有效扩增的引物11条，在扩增条带数目和位置上有明显差异，可用于鉴别。 结论：应用分子生物学技术进行利子鉴别研究，消除了种子性状特征易受外界环境影响的特点，可以较根本的揭示黄芩及其混淆品之间的差异。不但为黄芩种源筛选提供依据，也为黄芩属的物种研究奠定了一定基础。 收起