摘要: 高盐能够破坏植物体内水势平衡和离子平衡，引起渗透胁迫和离子毒害，从而导致细胞分子损害，生长受到抑制甚至死亡。植物感受到离子胁迫和渗透胁迫信号以后，经离子和渗透信号途径改变体内许多基因的表达，诱导产生相应分子以保护细胞正常的生命活动... 展开 高盐能够破坏植物体内水势平衡和离子平衡，引起渗透胁迫和离子毒害，从而导致细胞分子损害，生长受到抑制甚至死亡。植物感受到离子胁迫和渗透胁迫信号以后，经离子和渗透信号途径改变体内许多基因的表达，诱导产生相应分子以保护细胞正常的生命活动和生长发育。SOS途径是植物应答离子胁迫一个主要途径，在这个途径中感应Ca2+信号的SOS3-SOS2蛋白激酶复合体调控离子转运蛋白的表达和活性如SOS1。本文利用mRNA差异显示技术从小麦中克隆了对盐胁迫应答的基因TaASN1同时从小麦中克隆了SOS途径中的两个关键基因TaSOS3和TaSOS1以及AtSOS4的同源基因TaPdxK。通过转化拟南芥、酵母或大肠杆菌的的方法研究了这些基因的功能，并对这些基因在环境因子胁迫下的表达情况进行了分析。主要研究内容结果如下： 1.盐胁迫应答基因的mRNA差异显示分析 利用mRNA差异显示技术对盐胁迫后小麦根部基因表达差异进行分析，共获得28条差异条带，其中10条为诱导表达18条为抑制表达。经RT-PCR分析验证，最终筛选鉴定出一个受盐胁迫诱导表达的cDNA片段。该基因编码依赖谷氨酸的天冬酰氨合酶基因。根据该序列在GenBank中进行相似性比较，获得了两个小麦的天冬酰氨合酶基因的全长mRNA序列。根据这两条序列设计引物从小麦中克隆了这两个基因，定名为TaASN1和TaASN2。其中TaASN1与最初克隆的cDNA片段是一致的。序列分析表明，TaASN1和TaASN2推测的氨基酸与其它物种天冬酰氨合酶的保守序列如谷氨酰胺结合基序、Ⅱ型谷氨酰胺氨基转移酶结构域等高度同源。由于天冬酰氨合酶的体外不稳定性，我们通过互补Escherichiacoli天冬酰氨营养缺陷型的方法验证了TaASN1的天冬酰氨合酶活性。RT-PCR表达分析表明TaASN1在非胁迫条件下根和地上部都有表达，但TaASN2表达非常弱。在NaCl胁迫条件下，小麦根和地上部TaASN1表达在短时间内有明显增强，并一直维持较高的水平。在ABA处理时，TaASN1在小麦根部的表达短时间内也有明显增强，在地上部的表达量增加的速率较慢，在24h后才有明显提高。TaASN1的表达同时还被甘露醇胁迫所诱导。推测盐诱导TaASN1的诱导表达很可能是通过依赖于或部分依赖ABA的渗透胁迫信号转导途径起作用的。 2.过量表达小麦Ca2+感应蛋白基因TaSOS3互补拟南芥sos3突变体AtSOS3编码含EF手型结构和十四烷基酰化基序的钙感应蛋白，属于类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurinB-likeprotein，CBL)家族的成员，该家族在拟南芥中至少有10个成员。根据AtSOS3的氨基酸序列对小麦的EST数据库进行搜索，结果得到146个小麦的EST序列。应用DNASTART的SEQMAN程序，将这些EST序列进行拼接组装，最终获得10个重叠群(contig)。将这10个重叠群翻译成氨基酸序列与AtSOS3和拟南芥的其他9个AtCBL蛋白的氨基酸进行聚类分析，结果发现有一个重叠群与AtSOS3非常相近，将其进行拼接获得小麦的TaSOS3的推测全长基因。根据推测序列设计引物进行RT-PCR扩增，最终获得包含完整开放阅读框的774bp小麦TaSOS3基因的cDNA。推测TaSOS3编码213个氨基酸的24.5kD的蛋白。用GCG软件进行保守区分析表明TaSOS3同样含有3个EF手性结构的Ca2+结合域，同时在其N端具有一个十四烷基酰化基序。AtSOS3的研究表明这两个结构特征，是其功能必须的(Ishitanietal.，2000)。根据TaSOS3基因cDNA序列设计引物对小麦基因组进行扩增，获得TaSOS3的基因组序列。小麦TaSOS3基因组序列有7个内含子8个外显子组成，与拟南芥AtSOS3基因内含子数目及其位置是一致的，进一步表明TaSOS3和AtSOS3是同源基因。在拟南芥的sos3突变体过量表达TaSOS3，可以有效的互补sos3突变体的盐敏感表型，从功能上也证明了TaSOS3与AtSOS3的同源性。通过RT-PCR的方法对TaSOS3在小麦中的表达模式进行分析表明，TaSOS3为根中特异表达。中等盐浓度和ABA可以诱导TaSOS3的表达，但高浓度盐处理抑制TaSOS3的表达。 3.小麦质膜Na+/H+逆转运体TaSOS1基因的克隆及功能分析 在高盐环境下，植物通过细胞质膜上的Na+/H+逆转运体将Na+从细胞质外排来降低细胞内的Na+浓度，是维持正常生长一个关键生理过程。我们根据已克隆的Na+/H+逆转运体基因的序列和Genbank中小麦的EST序列设计引物进行RT-PCR。从小麦中克隆到了与拟南芥AtSOS1基因非常相似小麦cDNA片段，并在此基础上，通过5’和3'RACE的方法分离获得了TaSOS1的全长cDNA。TaSOS1cDNA全长3717bp，推测编码1142个氨基酸的126.4kD的蛋白。NCBI保守性区域分析发现TaSOS1在N端含一个Na+/H+Exchanger区，在中部含有一个cAMP结合区(CRP)。TMPRED程序预测该基因在N端是高度疏水的，含有12个穿膜结构，在C端是高度亲水的尾部。通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法分析TaSOS1的亚细胞定位，结果TaSOS1-GFP融合蛋白清晰的定位于洋葱表皮的细胞膜上，证明TaSOS1确实是位于细胞质膜上的。为验证小麦中3个Na+/H+逆转运体基因的活性，分别将他们过量表达于酵母Na+超敏感突变体中，结果发现TaSOS1不仅具有较强的Na+转运活性而且还具有Li+的转运活性，TaNHX2仅有较弱的Na+转运活性，而没有检测到TaNHX1活性。将TaSOS1在拟南芥突变体sos1-1过量表达，转基因植株进行抗盐分析表明过量表达TaSOS1可以部分互补拟南芥突变体盐敏感的表型。小麦的3个Na+/H+逆转运体基因表达的RT-PCR分析表明，与拟南芥AtSOS1在盐胁迫下表达量明显提高不同，TaSOS1在小麦的根部和地上部在盐胁迫处理时，表达量仅有微弱提高，而且TaSOS1还受ABA的微弱诱导。TaNHX2的表达模式与TaSOS1不同，在盐胁迫和ABA处理后，TaNHX2的mRNA水平在小麦的根和地上部中明显提高。有趣的是，在不同盐浓度下TaNHX2的表达模式不同，在150mMNaCl胁迫时，TaNHX2在根和地上部表达迅速提高并维持这个水平，与ABA处理的表达模式相似，而在250mMNaCl处理时，TaNHX2，在根部3h和7h增加，24h时恢复到胁迫前的水平，而在地上部与之相反表达量仅24h时有明显增加。这说明小麦在受不同盐浓度胁迫时可能采用不同的信号途径调控细胞内离子平衡。 4.小麦吡哆醛(维生素B6)激酶基因TaPdxK的克隆 吡哆醛(PL)激酶(EC2.7.1.35)催化维生素B6的前体[吡哆醇(PN)，吡哆醛(PL)和吡哆胺(PM)]磷酸化，形成具有生物活性的维生素B6——磷酸吡哆醇(PLP)。Shi等(2002b)通过对拟南芥盐敏感型突变体sos4的研究，发现该突变体为PL激酶(AtSOS4)基因突变，从而揭示了维生素B6在植物抗盐过程中发挥着重要的作用。根据拟南芥AtSOS4基因的序列和Genbank中小麦的EST序列设计引物进行RT-PCR，获得小麦的PL激酶基因的cDNA片段，在这个片段的基础上，通过5’和3'RACE的方法获得了全长cDNA，该基因定名为TaPdxK。推测TaPdxK编码309个氨基酸残基的34.2kD的蛋白，与拟南芥AtSOS4基因的一致性为78％，相似性有89％。以TaPdxK的全长cDNA为探针对小麦基因组进行Southern分析表明，在小麦的基因组中至少有两个同源基因存在。通过互补大肠杆菌中维生素B6合成缺陷突变体，验证了TaPdxK的PL激酶活性。将TaPdxK在大肠杆菌中过量表达，提取粗蛋白进行体外酶活力测定，直接证明了TaPdxK的PL激酶活性。RT-PCR表达分析表明TaPdxK在小麦的根、叶、幼穗和花药中都有较强的表达，但在NaCl、ABA和甘露醇等胁迫条件下其表达并没有明显变化。 收起