摘要:
高盐胁迫能够破坏植物体内的水势平衡和离子平衡,引起渗透胁迫和离子毒害,导致细胞分子损害,生长受到抑制甚至死亡。植物感受到离子胁迫和渗透胁迫信号以后,经离子和渗透信号途径改变体内许多基因的表达,诱导产生相应的分子,调整生理状态,以保护细胞正...
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高盐胁迫能够破坏植物体内的水势平衡和离子平衡,引起渗透胁迫和离子毒害,导致细胞分子损害,生长受到抑制甚至死亡。植物感受到离子胁迫和渗透胁迫信号以后,经离子和渗透信号途径改变体内许多基因的表达,诱导产生相应的分子,调整生理状态,以保护细胞正常的生命活动和生长发育。SOS途径是植物应答离子胁迫(特别是盐胁迫)的一个主要途径。以研究小麦抗盐分子机理为目的,以抗盐小麦品种科遗26为材料,采用同源克隆的方法,从小麦中克隆了SOS途径中的两个关键基因TaSOS2和TaCBL10。通过转化拟南芥、酵母等方法研究了这些基因的功能,并对这两个基因在环境因子胁迫下的表达情况进行了分析。主要研究结果如下: 1.小麦Ca2+感应蛋白基因TaCBL10的克隆与功能分析 通过对小麦EST数据的分析,克隆了小麦中与AtCBL10高度同源的Ca2+感应蛋白基因TaCBL10。洋葱表皮的亚细胞定位结果表明,TaCBL10定位在细胞膜上。TaCBL10高水平表达于叶、茎及花药中,在根、幼穗、种子及胚中的表达量很低。对小麦幼苗地上部TaCBL10基因的表达分析发现,盐胁迫诱导TaCBLJD表达量的增加,250mM NaCl处理1h,小麦幼苗中TaCBL10的表达就受到轻微的上调,随着处理时间的延长表达量逐渐增强,处理后12h时表达量达到最高,随后表达量略有降低但仍然保持较高的表达水平。本研究还发现ABA对TaCBL10的mRNA积累具有一定的诱导作用。ABA对TaCBL10的诱导作用是在6 h才检测到,而盐胁迫的诱导在1h就可以检测到,说明ABA的诱导和盐胁迫诱导很可能是相对独立的过程。在拟南芥突变体scabp8中过量表达TaCBL10可以互补突变体scabp8的盐敏感表型。 2.小麦Ser/Thr蛋白激酶基因TaSOS2的克隆与功能分析 根据拟南芥SOS2基因的cDNA编码序列,通过电子拼接结合3’-RACE和5’-RACE克隆了小麦SOS2同源基因TaSOS2。测序分析发现小麦的SOS2存在三个不同的拷贝,不同拷贝间只是在编码序列上存在一些SNP的差异,分别命名为TaSOS2-1、TaSOS2-2、TaSOS2-3。在ABA和NaCl胁迫处理下,TaSOS2基因的诱导表达模式基本类似,都是在处理后12小时达到第一个峰值,随后表达量下降,但NaCl处理后48小时,基因的表达量又再次升高达到峰值。TaSOS2基因的胁迫诱导表达模式与TaCBL10的诱导表达模式非常一致。不同时期部位的RT-PCR结果表明,TaSOS2在各个部位都有表达,以茎和叶中的表达最强,这也与拟南芥中SOS2的表达相似。 利用酵母双杂交技术检测了TaSOS2不同拷贝与上游互作蛋白SOS3、CBL10及ABI2的相互作用情况。结果表明,TaSOS2-1与SOS3及CBL10具有较强的相互作用,TaSOS2-3与SOS3的相互作用较弱且不能和CBL10相互作用,TaSOS2-2完全丧失了与SOS3和CBL10相互作用的能力。三个拷贝都不能与ABI2相互作用。通过定点突变的方法构建单氨基酸突变的酵母双杂交载体,用以研究不同拷贝间单个氨基酸变化对SOS2功能的影响。结果表明,TaSOS2-1的248位的Asn(N)突变为Thr(T),253位Ile(I)突变为Met(M),使突变体丧失了与SOS3相互作用的能力。同时也研究了这两个氨基酸的突变对拟南芥SOS2和SOS3相互作用的影响,结果表明,248位Asn突变为Thr影响了AtSOS2与ABI2的相互作用,253位Ile突变为Met,使AtSOS2丧失了与上游相互作用蛋白的结合能力。 TaSOS2-1可以互补sos2突变体的表型,TaSOS2-2和TaSOS2-3不能互补突变体的表型。TaSOS2-168TM不能互补sos2的盐敏感表型。这说明,Thr168位点的磷酸化对于SOS2的活性具有重要影响。盐敏感表型分析发现,在不同浓度的盐胁迫下,TaSOS2-248NT过表达植株表现出和野生型相似的表型。过量表达TaSOS2-253IM不能互补突变体的盐敏感表型,该氨基酸的突变使得TaSOS2丧失了功能。在50 mM NaCl处理下,AtSOS2-248N/T和AtSOS2-253I/M能不同程度互补突变体的盐敏感表型,过量表达AtSOS2-248N/T的转基因植株的表型与野生型没有差异,但AtSOS2-253I/M转基因植株的根的生长要比野生型差,只比突变体稍好；在75mM NaCl和100mM NaCl处理下,AtSOS2-248N/T和AtSOS2-253I/M过表达植株的根中表现出盐敏感表型,且具有剂量效应,随着盐浓度的增加,敏感表型更为明显。进一步说明这两个氨基酸突变对SOS2的功能非常重要,其突变可能影响了SOS2与SOS3的相互作用,从而使过表达植株表现出根敏感的表型。
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