摘要: 本文对影响油料作物大豆耐逆性的两个重要基因进行了克隆和相关研究，同时通过借鉴国际研究前沿利用这两个基因构建了合适的植物表达载体，并转入不同的植物以验证其对转基因植物耐逆性的提高、及其它可预见的生物学效应，为以后该领域的研究提供了有... 展开 本文对影响油料作物大豆耐逆性的两个重要基因进行了克隆和相关研究，同时通过借鉴国际研究前沿利用这两个基因构建了合适的植物表达载体，并转入不同的植物以验证其对转基因植物耐逆性的提高、及其它可预见的生物学效应，为以后该领域的研究提供了有用的信息。具体内容包括以下三个方面：1.植物体内有着与细菌类似的细胞分裂素的生物合成途径，即由异戊烯基转移酶限速的细胞分裂素从头(devono)合成途径。在本研究中一个编码大豆异戊烯基转移酶(IPT)的基因通过对大豆EST数据库的搜索和RACE扩增的方法得到了克隆，就其表达模式和序列相似性而言该基因与拟南芥AtIPT5最为相近。Southern杂交结果表明在大豆基因组中存在着两个拷贝的GmIPT基因。以35S-GmIPT转化的烟草植株的表型说明由GmIPT基因所编码的蛋白能够产生有活性的细胞分裂素。利用TAIL-PCR的方法成功的分离了两个该基因5’端的调控序列(750bp、700bp)。利用数据库辅助的启动子分析预测显示，该调控区与拟南芥和水稻中IPT基因的5’端的调控序列共有一些可能的转录因子结合位点(顺式调控元件)。通过对GmIPT基因的RT-PCR和pGmIPT-GUS转基因拟南芥的研究表明，GmIPT基因在叶和根中有着组成型的表达模式，同时该基因在这些组织中的表达又具有很高的特异性。Northern杂交不能检测到相应的杂交信号，说明该基因的转录水平很低。对植物激素处理的大豆幼苗定量PCR和对PGmIPT-GUS转基因拟南芥幼苗的类似研究结果都表明该基因的表达受到环境胁迫和其它植物激素和化学因子的调控，证明所预测的顺式调控元件是真实存在和具有调控功能的。另外本文还就各种环境因子和植物激素如何参与植物体内细胞分裂素生物合成的调控进行了讨论。 2.SAG12是拟南芥中一个编码半胱氨酸蛋白酶的基因，其表达仅限于衰老的植物组织中。该基因的表达特异性的受到由植物发育程序控制的衰老信号通路的激活，而不受胁迫或激素控制的信号通路的调节。以该基因的启动子调控IPT基因的表达在转基因植物中已有成功应用。APETALA3是拟南芥花瓣和雄蕊形态发生过程中必不可少的一个花器官同源异形基因，其表达只限定在将来发育成花瓣和雄蕊原基的分生组织区内，并且其表达在这些器官之后的发育过程中一直存在。启动子∷GUS转基因研究表明该基因的表达是高度花器官特异性的。本研究中利用上述两个植物发育阶段(衰老期)和器官(花)特异性的启动子和IPT基因构建新型植物表达载体，从而实现IPT基因在植物特定发育阶段和特定组织内的表达，产生预期的生物学效应(如降低花和果荚的脱落、延长花期和生长期等)。并获得了pCAMBIA1300-PSAG12-IPT-PAP3-IPT转基因拟南芥，其生物学效应有待于进一步观察和研究。 3.高等植物具有一个大的热激转录因子家族，在介导植物的热激响应和激活热激蛋白基因转录过程中担负着不同的角色。同时已有研究表明番茄中具有组成型表达模式的LpHSFA1在番茄的热激反应中起着“管家”(master)的作用，其过量表达能够激活其它热激转录因子和热激蛋白的组成型表达。本研究通过RT-PCR的方法研究了大豆A1类热激转录因子基因(GmHsfA1)的表达模式及其表达对环境胁迫的响应，结果表明该基因在大豆的各种组织内有着组成型的表达，是非诱导型的A1类热激转录因子；同时其表达在叶片和下胚轴中基本不受热激和盐胁迫的诱导，其表达在上述胁迫环境下仅在根中有着较强的响应。同时发现植物激素对该基因的表达具有抑制作用，暗示在植物热激响应和激素信号传导两个通路之间存在着某种对话(crosstalk)。通过核酸和蛋白水平上的序列比较分析和表达特征研究，说明所分离的该热激转录因子很可能就是大豆中的“管家”热激转录因子GmHsfA1基因。该热激转录因子在转基因大豆中的过量表达可以激活热激蛋白Hsp70基因在常温情况下的组成型表达，并明显提高了转基因植株的耐热性，这也说明所克隆的GmHsfA1编码了一个有功能的热激转录因子。同时说明通过过量表达GmHsfA1来提高大豆的耐热性是可行有效的，为降低大豆在逆境条件下花和果荚的败育率提供了一个值得进一步探索的途径。 收起