摘要: 大豆是我国重要的粮食和油料作物，但大豆生产远不能满足国内需求，因此急需加快大豆分子育种步伐。但是大豆分子育种的发展深受大豆再生体系建立难、遗传转化效率低的阻碍。大豆再生体系的建立应先清楚与大豆再生相关的关键基因功能及其作用机理，才... 展开 大豆是我国重要的粮食和油料作物，但大豆生产远不能满足国内需求，因此急需加快大豆分子育种步伐。但是大豆分子育种的发展深受大豆再生体系建立难、遗传转化效率低的阻碍。大豆再生体系的建立应先清楚与大豆再生相关的关键基因功能及其作用机理，才能为最终建立高效、稳定的大豆再生体奠定基础。 AtLEC1在体细胞胚胎发育的过程中起着至关重要的调节作用，本研究通过同源克隆方法从大豆中获得GmLEC1基因，并通过生物信息学等相关技术手段对该基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析，通过遗传转化大豆及拟南芥进行再生基因的功能初步验证，主要实验结果如下: (1)本研究利用同源克隆技术通过对拟南芥再生相关基因LEC1进行同源序列比对，从大豆中克隆LEC1基因两个成员的全长CDS序列，得到大豆再生相关基因GmLEC1-a，GmLEC1-b，GmLEC1-a编码区长度为672 bp，编码223个氨基酸，GmLEC1-b编码区长度为681 bp，编码226个氨基酸。 (2)运用生物信息学方法对大豆GmLEC1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明，GmLEC1蛋白为亲水性不稳定蛋白;通过对LEC1蛋白功能结构域进行分析发现，GmLEC1为H2A超家族成员，并与拟南芥属植物亲缘较近。 利用MEGA5软件构建大豆GmLEC1基因与其他物种LEC1基因的系统进化树，结果表明大豆GmLEC1基因与拟南芥属亲缘关系较近。 (3)采用荧光定量RT-PCR方法对GmLEC1-a基因的组织特异性表达进行分析，结果表明GmLEC1-a基因在未成熟种子中的表达量最高，其次是花。 (4)激素表达模式分析大豆GmLEC1-a基因受激素(GA3，6-BA，IAA，ABA)诱导情况，结果表明GmLEC1-a基因受这几种激素的诱导。 (5)构建了植物表达入门载体pGWC和植物表达载体pGWB5-GmLEC1-a，转化大肠杆菌和农杆菌，并通过与PCR相结合的方法对结果进行验证。 (6)通过农杆菌介导采用花絮浸染法、子叶节法分别对拟南芥大豆进行遗传转化，并且通过PPT筛选和PCR鉴定的方法对过表达植株进行鉴定，将目的基因GmLEC1-a转入植物体中并收获种子，通过PPT筛选和PCR鉴定的方法对过表达植株后代进行检测，同时用荧光成相仪对转基因大豆苗进行荧光蛋白分析。 (7).当在GmLEC1-a突变体和在野生型拟南芥过量表达该基因时，观察表型可知，GmLEC1-a基因在拟南芥中的缺失表达和在野生型中过量表达会导致植株幼苗的根较CK的短小，子叶无法张开或生长缓慢，而含有该基因的野生型拟南芥表形正常。 对拟南芥植株的表型进行初步分析，发现GmLEC1-a基因在拟南芥中的缺失表达会导致植株矮化，子叶较野生型的小，大多数花不能正常生长。 收起