摘要: 本项研究包括三部分：1.2型糖尿病家系中高甘油三酯血症患者脂蛋白脂酶基因分子筛查 目的：对成都地区汉族人群2型糖尿病(T2DM)家系中伴高甘油三酯血症(HTG)患者进行脂蛋白脂酶(LPL)基因分子筛查。方法：选取成都地区汉族人群中符合入选条件的T2DM... 展开 本项研究包括三部分：1.2型糖尿病家系中高甘油三酯血症患者脂蛋白脂酶基因分子筛查 目的：对成都地区汉族人群2型糖尿病(T2DM)家系中伴高甘油三酯血症(HTG)患者进行脂蛋白脂酶(LPL)基因分子筛查。方法：选取成都地区汉族人群中符合入选条件的T2DM家系，从T2DM家系中选择TG≥2.25mmol/L的患者进行LPL基因分子筛查，53人符合此标准，其中T2DM患者31人，糖耐量减低者(IGT)11人，糖耐量正常(NGT)者11人，这53人共代表了26个T2DM家系，TG范围在2.3-13.0mmol/L。正常对照118例。用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)对LPL基因进行突变检测，然后对检出的突变位点通过DNA序列分析进一步证实，对发现突变位点的家系成员进行筛查，同时在正常群体中筛查这些突变位点的频率。对所有研究对象均进行血糖、血脂和胰岛素测定，计算体重指数(BMI)。 结果：1.在LPL基因外显子检测到7种突变，分别是：Ala71Thr、Val108Val、Leu286Pro、Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu。其中Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu是本研究中新发现的突变位点，以前从未报道过。 2.对新发现的Lys312insC和Thr361insA突变位点在家系成员中进行进一步筛查，结果显示8#家系同时携带了Asn291Ser和Lys312insC突变，这两突变相互间有协同效应，并与家系中HTG呈共分离现象。在14#及28#家系中均发现了Thr361insA突变，通过家系内关联分析显示Thr361insA突变与家系中HTG呈显著相关。上述突变均未在正常对照中检测到。 3.在新1#和新3#家系的先证者中筛查到了Leu286Pro和Ala71Thr突变，其中新1#家系的先证者是一位39岁男性，其TG为11.9mmol/L；新3#家系的先证者为一位40岁的男性，其TG为13.0mmol/L，由于Leu286Pro和Ala71Thr突变曾经被报道过，并且均进行了体内及体外的功能研究，显示这两者突变均可以导致其产物LPL活性缺乏，从而使血中TG极度升高。因此考虑Leu286Pro和Ala71Thr突变是这两个家系成员HTG的直接原因。 结论：在成都地区汉族人群T2DM家系中伴HTG患者LPL基因的突变频率较高；部分家系的HTG是由于LPL基因突变直接导致的。 2.野生型人LPLcDNA重组质粒的构建、克隆和鉴定 目的：获取野生型人LPLcDNA重组质粒，为下一步进行LPL基因的体外定点突变及体外表达提供一个必要条件。 方法：逆转录PCR(RT-PCR)法从人的大网膜脂肪组织获取人LPLcDNA基因，选用pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体，运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒；对重组质粒进行限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定。 结果：经过限制性内切酶酶切及PCR鉴定证实LPL基因已克隆到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中，DNA双向测序证实与基因库中LPL基因的序列完全一致。 结论：成功构建了野生型人LPLcDNA重组质粒，为下一步进行LPL基因的体外定点突变及体外表达奠定了实验基础。 3.LPL基因的体外定点突变及体外表达 目的：对LPL基因进行Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC定点突变；同时在体外研究这四个突变LPL基因的功能。 方法：采用定点突变试剂盒对LPL基因进行体外定点突变；采用了阳性脂质体Lipofectamine2000将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞；细胞培养分7组：空白对照组即不给予任何干预，阴性对照组即用空质粒pcDNA3.1Zeo(+)进行转染，阳性对照组即用野生型重组质粒进行转染和四个实验组即分别用4个突变型重组质粒进行转染。细胞裂解液及细胞培养基LPL浓度的检测采用的是人LPLELISA试剂盒；细胞裂解液及细胞培养基LPL活性的检测采用的是分光光度计法。 结果：1.通过DNA双向测序证实，除导入的特异突变位点外无其它新的突变产生。突变的pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA重组质粒构建成功。 2.用RT-PCR法对细胞裂解液及培养液进行扩增，结果示：除空白及阴性对照孔未扩增出条带外，其余各组均扩增出一条特异性条带，其片段大小为1455bp，说明野生型及突变型重组质粒pcDNA3.1Zeo(+)-LPL基因在真核COS-1细胞中转染成功。 3.对各组细胞裂解液及细胞培养基LPL浓度的检测，结果显示：在细胞裂解液中，野生型LPL转染的COS-1细胞LPL浓度为298±14ng/ml，四组突变的LPL转染的COS-1细胞LPL浓度有轻度下降趋势，但与野生型组相比，均未达到统计学意义；在细胞培养基中，野生型LPL转染的COS-1细胞培养基LPL浓度为277±7ng/ml，四组突变的LPL转染的COS-1细胞培养基LPL浓度显著下降，与野生型组相比，均达到了统计学意义。 4.对各组细胞裂解液及细胞培养基LPL活性的检测，结果显示：在细胞裂解液及细胞培养基中，野生型转染的COS-1细胞LPL活性分别为1.69±0.03和1.47±0.02FFAumol/ml·h；相对于野生型来说，无论是细胞裂解液还是细胞培养基中，四组突变组的LPL活性均发生了显著的降低，其中在Asn291Ser+Lys312insC组未检测到LPL活性，Thr361insA组LPL活性约为野生型的20％，Lys312insC组LPL活性约为野生型的12％以及Asn291Ser组LPL活性约为野生型的60％。 结论：成功地完成了LPL基因的体外定点突变；LPL的Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC四种突变均没有影响到LPL的转录和翻译，但在不同程度上都影响到了LPL向细胞外的分泌，且都显著降低了LPL的活性，四个突变均为功能性突变。 收起