摘要: 棉花是重要的天然纤维，海岛棉因为纤维细长、富有丝光、强力较高成为纺织高档和特种棉纺品的重要原料。育种家一直希望能把其优良的纤维性状转育到陆地棉中。但是陆地棉和海岛棉种间杂交后代疯狂分离，给育种工作带来了很大的困难。有关棉花纤维发育... 展开 棉花是重要的天然纤维，海岛棉因为纤维细长、富有丝光、强力较高成为纺织高档和特种棉纺品的重要原料。育种家一直希望能把其优良的纤维性状转育到陆地棉中。但是陆地棉和海岛棉种间杂交后代疯狂分离，给育种工作带来了很大的困难。有关棉花纤维发育分子机理的研究虽然开展得不少，但主要集中在陆地棉，并且构建的陆地棉或者亚洲棉纤维eDNA文库也只是早期或者伸长期等某一特定发育时期的文库。海岛棉纤维发育机制的研究基本上还没有启动，在GenBank中注册的海岛棉的：ESTs序列也不超过100条(2006年11月)。在本研究中构建了基本覆盖整个发育期的海岛棉纤维(-2～25DPA)eDNA文库。并对海岛棉纤维发育不同时期进行了表达谱分析，同时还分析了相同发育时期海岛棉和陆地棉表达谱的差异。丰富了棉花特别是海岛棉的ESTs数据，发掘了一些可能对纤维发育有重要作用的基因。主要结果如下： 1．构建了四个独立的Pima 3-79纤维cDNA．文库(-2～4 DPA，5～10 DPA，11～16 DPA和17～25 DPA)，在此基础上利用基因组DNA饱和杂交方法，构建平衡化cDNA文库(-2～25 DPA)。此文库插入片断大小主要分布范围在0.8 kb到1.5kb，平均长度为1.14kb。 2．随机挑取文库克隆抽提质粒，点制了包含有9126个质粒的array。然后用Pima 3-790 DPA(胚珠)，5 DPA，10 DPA，15 DPA和20 DPA纤维的RNA与array杂交，挑取在任何两个时期表达有差异的929个克隆进行测序，一共得到887条高质量的的ESTs。 3．887条ESTs被装配成645条consensus sequences(582条singletons和63个contigs)o在这645条consensus sequences中，有455条序列采用gene ontology(GO)被归到了一定的功能类别。其中有50％的序列被归到了代谢功能类。 4．用887条ESTs点制了sub-array，然后用Pima 3-79 0 DPA，5 DPA，10DPA,15 DPA和20 DPA纤维RNA，以及非纤维组织RNA等量混合物与sub-array杂交进行表达谱分析，发现有118条ESTs是组成型表达的，剩下的663条ESTs中的596条ESTs(67条EST没被归类)根据其表达特性被分成7类。 5．表达谱分析过程中我们发现了很多可能在纤维发育中起关键作用的基因：GbF3H，GbPDF，GbGLP，GbBHLH，GbarCaM，GbERS，GbCTLs，GbTLPs。 6．比较了两个棉种10 DPA和20 DPA纤维的表达谱的差异。在10DPA，发现海岛棉76条ESTs表达水平上调而陆地棉中只有19条ESTs表达上调；在20 DPA发现陆地棉中只有134条ESTs表达水平上调而海岛棉19条ESTs表达上调。这些差异可能可以部分地解释海岛棉和陆地棉纤维品质和产量的区别。 7．在表达谱分析过程中，发现海岛棉和陆地棉纤维发育相关的基因氨基酸序列和核苷酸序列存在明显的差异，除了核苷酸的差异外，还有明显的序列插入(缺失)，特别是3’-UTR。如GbPDF与GhPDF1；expansins；GbGLP与GhGLP。 8．改造了pCAMBIA2301，通过PeR介导突变法去掉NPTⅡ上游的NcoⅠ、Bgl Ⅱ两个酶切位点并将其命名为pCAMBIA2301m，目前已应用到超表达基因功能验证上。 9．分析了GbEX2和GbEX3的表达特性，GbEX2为海岛棉纤维特异表达基因，GbEX3在海岛棉和陆地棉的纤维中特异表达。并将其进行了RNAi抑制和超表达的转基因，目前已经得到再生苗。 10．克隆了GbEX2和GbEX3的启动子，并分析了其核心启动子的序列及其顺式作用元件。GbEX2和GbEX3的启动子序列整体上相似性较高，但存在碱基的差异和序列插入(缺失)，可能就是这些差异造成了两个基因表达的差异。我们还将启动子构建到pBl121和pBINm-gfp5-ER载体上转化了陆地棉品系YZ1。 11．根据常见的看家基因设计了7对引物(18S rRNA，Histone3，UBQ7,Actin，Cyclophilin,Gbpolyubiquitin-1和Gbpolyubiquitin-2)，用相对的绝对定量法验证了在棉花不同组织和不同发育阶段(22个样品)表达水平的稳定性。发现在纤维发育的后期(17 DPA以后)这些基因都表达下调，而纤维发育后期特异表达基因．AGP从15开始到27 DPA一直都呈上升表达趋势。 12．根据结果，对于非纤维系列为了得到更精确的表达数据，应该同时用Histone3，UBQ7和Gbpolyubiquitin-1一起来平衡化qRT-PCR数据；对于纤维系列更好的选择是相对的绝对定量。 收起