摘要: 研究目的 1、研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片。 2、通过miRNAs芯片杂交，获取CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱。 3、生物信息学分析预测并验证miRNAs作用靶点。 4、探索miRNAs在造血干细胞发育中的作用。 研究内容和方法 ... 展开 研究目的 1、研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片。 2、通过miRNAs芯片杂交，获取CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱。 3、生物信息学分析预测并验证miRNAs作用靶点。 4、探索miRNAs在造血干细胞发育中的作用。 研究内容和方法 1、研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片以己知哺乳动物基因组miRNAs序列为依据，合成相应DNA探针，制作新型哺乳动物miRNAs检测基因芯片。 2、CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱的筛选流式细胞仪细胞分选人脐血CD34+CD38-造血干细胞及CD34+造血祖细胞，提取其总RNA，分离纯化18-100nt小片段RNA，经扩增及荧光标记后，与基因芯片进行分子杂交，获得CD34+CD38-造血干细胞miRNAs表达谱。 3、实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)对miRNAs芯片结果的验证选取6个在CD34+CD38-造血干细胞中差异表达的miRNAs，以Q-RT-PCR加以验证，对miRNAs芯片结果进行初步验证，对结果一致的miRNAs行3次重复实验以确证Q-RT-PCR结果的可靠性。 4、生物信息学分析及miRNAs作用靶点的验证生物信息学分析miR-129、miR-526b*和miR-520h的染色体定位、保守性分析等，利用网络共享软件picTar、miRanda 3.0和targetscan3.1，分析其可能作用的靶基因。 选择在CD34+CD38-差异较为显著的miR-129、miR-520h的进行作用靶基因的验证。首先合成与miRNAs结合的靶位点DNA序列及互补序列，并分别在两条寡核苷酸5′端悬垂添加Hind Ⅲ和Spe Ⅰ酶切位点；退火形成形成带酶切位点的双链插入序列，与线性化pMIR-REPORT荧光素酶(Luc)报告基因载体(pMIR-Luc)连接构建重组载体(pMIR-Luc-miR)，并进行酶切及测序验证。 重组载体(pMIR-Luc-miR)、标准化对照载体pMIR-REPORT-β-gal(pMIR-β-gal)与miRNAs前体(Pre-miRNAs)共转染HeLa细胞(实验组)，72h后分别检测HeLa细胞的荧光素酶(Luc)和β半乳糖苷酶(β-gal)的活性，计算二者的比值(Luc/β-gal)。同时设立三个对照组(no miRNA空白对照组、Pre-miR-negative阴性对照组和Anti-miRNAs反证对照组)，比较各组的Luc/β-gal比值，验证miRNAs作用靶点的真实性。 5、miR-520h促进造血发育功能研究选择在CD34+CD38-造血干细胞中高表达的miR-520h，研究其在促进造血发育中的作用。流式细胞仪分选的CD34+细胞，miR-520h转染CD34+细胞，转染后24h行CFC实验检测CD34+细胞集落形成能力改变，转染后72h行FACS检测CD34+、CD34+CD38-细胞比例变化，同时设立三个对照组(no miRNA空白对照组、Pre-miR-129阴性对照组和Anti-miR-520h反证对照组)，分析miR-520h在促进造血发育中的作用。 研究结果 1、成功研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片整个点阵分成4个亚阵，每个亚阵有23行，21列，点间距为185μm，点的直径约为130μm。每条探针重复三次。为保证实验的可靠性，在芯片的不同部位多次设定各种对照，经点样后芯片共有1754个位点，包含469个miRNAs序列，总共588个基因(每个基因重复3个位点)。 2、CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs的筛选与CD34+细胞miRNAs表达微阵列比较，HSC细胞共筛选出31个miRNAs，其中4倍低于CD34+细胞的miRNAs为22个(包括miR-129等)，4倍高于CD34+细胞的miRNAs为9个(包括miR-526b*和miR-520h等)，其中预测的miRNAs(PREDICTED MIR)为4个。 3、实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)对miRNAs芯片结果的验证选取6个CD34+CD38-造血干细胞中差异表达的miRNAs，以Q-RT-PCR加以验证，与芯片结果的吻合率达到50％，两种实验结果相符的miRNAs为：CD34+CD38-造血干细胞低表达的miR-129和CD34+CD38-造血干细胞中高表达的miR-526b*和miR-520h，相对于CD34+细胞的相对表达率分别为0.160±0.005、2.276±0.058和5.596±0.861。 4、生物信息学分析及miRNAs作用靶点的验证利用在线软件Pictar、miRanda 3.0和targetscan3.1分别预测miR-129、miR-526b*和miR-520h的作用靶基因。结果发现，①miR-129在人、鼠、狗、猩猩、鸡等动物中保守存在33个可能的靶基因，包括EIF2C3、CAMTA1、SH3KBP1、TGIF2、ING3、DLGAP2等与miRNA加工、转录因子、信号转导等相关的基因。②miR-526b*仅在人类存在，其可能的作用靶点有771个，包括ABCG2、EIF2C3、CAMK4、CSF2RA等关于信号转导、转录因子、造血发育、凋亡调控、干细胞功能维持、miRNAs加工成熟的基因。③miR-520h共有226个可能的作用靶点，在人类、小鼠和类人猿中保守的靶基因共有30个，包括ABCG2、ID1(DNA结合抑制剂1)、SRP19(一种信号识别蛋白)以及SMAD6(一种转录调控因子)等与干细胞功能维持、转录、信号转导等相关的调控蛋白。 实验表明miR-520h具有促进造血干细胞发育和分化的功能。 结论 1、成功研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片，表明利用miRNAs基因芯片来获取CD34+CD38-造血干细胞相关miRNAs是可行的，也为研究其它成体干细胞miRNAs表达谱建立了技术平台。 2、筛选到CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱，并部分经实时定量RT-PCR验证，为探讨miRNAs参与CD34+CD38-造血干细胞发育分子机制和生物功能研究奠定了基础。 3、验证了miR-129和miR-520h部分作用靶点，表明miRNAs通过调控EIF2C3、CAMTA1、ABCG2等在miRNA加工、转录因子、信号转导、干细胞功能维持等方面的靶基因，从而参与造血干细胞的发育，并形成miRNAs基因网络，在造血干细胞发育进程中起着协同或者拮抗作用。 4、miR-520h具有显著的促进造血干细胞发育和向祖细胞分化的作用。研究结果不仅对miRNAs作为促进造血发育的分子靶点的探索具有重要的应用前景，而且对于发育生物学、发展组织工程和再生医学都具有重要的理论意义。 收起