摘要: 癫痫是神经系统常见病。女性患者的癫痫发作与月经周期密切相关，动情前期的雌性大鼠癫痫发作阈值最低，这均提示癫痫发作与血清中雌激素水平升高和/或孕激素水平降低有关。 在临床和动物研究中，孕激素的抗痫作用已基本肯定，但雌激素在癫痫中的作... 展开 癫痫是神经系统常见病。女性患者的癫痫发作与月经周期密切相关，动情前期的雌性大鼠癫痫发作阈值最低，这均提示癫痫发作与血清中雌激素水平升高和/或孕激素水平降低有关。 在临床和动物研究中，孕激素的抗痫作用已基本肯定，但雌激素在癫痫中的作用结果不一。本文前期的研究发现，大剂量雌激素具有促进去势大鼠癫痫发作的作用，但如何界定大剂量还是小剂量?大、小剂量雌激素对癫痫究竟有什么不同作用?国内外文献均无系统研究。因此，本研究在界定雌激素添加大、小剂量的基础上，对不同剂量雌激素预处理在癫痫发作中的作用进行较为详细的了解，包括选择癫痫发作潜伏期和严重程度作为动物行为学的评估；以海马各区细胞计数作为海马损伤程度的细胞学比较；选择海马氨基酸类神经递质变化、血清雌二醇水平和海马雌激素β受体表达等作为衡量雌激素作用的生化指标。 癫痫的病因和影响因素非常复杂，如果雌激素预处理对癫痫发作产生了影响，本文希望进一步了解“雌激素对癫痫发作海马的影响究竟涉及了哪些基因?表达改变的基因可能涉及了哪些功能”? 本课题由三部分工作构成，目的是探讨雌激素对癫痫发作的影响。 第一部分雌激素预处理去势大鼠癫痫发作模型制备及行为学观察 目的：(1)了解雌性大鼠去势(Ovx)后不同时间点及添加不同剂量雌激素后血清性激素的水平，筛选出具有代表性意义的大、小剂量雌激素作为致痫前动物的预处理剂量；(2)评价雌激素预处理后选择致痫时间点的合理性，明确雌激素预处理对致痫大鼠动物行为学的影响。 方法：光镜观察雌性大鼠阴道细胞涂片，了解其生理周期和去势后的细胞学特征，用电化学发光法测定动情前期、Ovx7d和Ovx13d以及用不同剂量苯甲酸雌二醇(EB：25ug/kg、1、2、4、8、和20mg/kg体重)处理5d后的去势大鼠血清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睾酮(T)的水平。在Ovx13d尾静脉注射海人藻酸(KA：5mg/kg)致痫，按Racine分级，记录癫痫发作潜伏期和严重程度。 结果：1)与正常雌性大鼠动情前期相比，去势大鼠阴道涂片显示内皮细胞很少，并且血清E2、P、T水平均降低；2)比较Ovx7d和Ovx13d时间点动物血清E2水平，两者无显著差异，故选择Ovx7d添加外源性EB是合理的；而Ovx13d的P水平降低和E/P比值升高，表明此时致痫容易成功；3)添加25ug/kgEB的动物血清E2、P和T水平均低于动情前期，但P水平高于Ovx动物；血清E2水平随着EB添加剂量增加而明显增加，添加2mg/kgEB的动物血清E2水平为可检测的最高极限。EB25ug/kg和EB2mg/kg组Ovx动物血清E2水平呈显著性差异，但P和T水平相仿，便于单独比较E2的作用。4)25ug/kg和2mg/kg的EB预处理均能缩短去势动物癫痫轻度发作的潜伏期，仅2mg/kgEB预处理缩短了重度发作潜伏期。 结论：去势大鼠阴道涂片细胞形态及性激素水平降低说明去势是成功的；选择25ug/kg和2mg/kg的EB分别作为小剂量、大剂量是有代表性意义的；在Ovx7d和Ovx13d时间点分别给予EB预处理和KA诱导癫痫发作是有根据的；两种预处理EB剂量均能缩短致痫大鼠“点燃”的潜伏期，大剂量EB预处理还能促进痫样放电的扩散。 第二部分雌激素预处理对KA致痫去势大鼠癫痫发作海马的影响 一.雌激素预处理对KA致痫去势大鼠海马神经元损伤的影响 目的：比较不同剂量雌激素预处理对致痫去势大鼠海马易损亚区神经元缺失的影响，探讨雌激素在癫痫发作中的作用。 方法：实验动物分为9组，即Ovx、Ovx+EB25ug、Ovx+EB2mg、Ovx+KA(轻度和重度)、Ovx+EB25ug+KA(轻度和重度)、Ovx+EB2mg+KA(轻度和重度)组。运用免疫荧光组化技术，以NeuN阳性细胞显示海马存活的神经元，应用Image-ProPlus5.1软件和SPSS11.5软件分别进行细胞计数和数据处理。 结果：1)EB预处理对非致痫鼠海马易损亚区单位长度上NeuN阳性细胞数均无影响；2)无论是否用EB预处理，癫痫发作后海马易损亚区均出现NeuN阳性细胞数减少；并随癫痫发作程度加重而加重；3)无论大剂量还是小剂量EB预处理，均能减轻致痫鼠海马NeuN阳性细胞缺失。 结论：1)癫痫发作是导致海马神经元死亡的主要原因，神经元缺失的程度随癫痫发作程度加重而加重。2)不论小剂量还是大剂量雌激素，虽不能完全消除癫痫发作造成的损伤，却具有减轻海马易损亚区神经元损伤的作用。 二.雌激素预处理对KA致痫去势大鼠海马氨基酸类神经递质的影响 目的：分析不同剂量雌激素预处理的去势大鼠以海人藻酸致痫前后海马氨基酸类神经递质的水平变化，了解氨基酸类神经递质变化、雌激素、癫痫发作之间的关系，探讨雌激素在癫痫发作中的作用。 方法：去势大鼠随机分为9组，即Ovx、Ovx+EB25ug/kg、Ovx+EB2mg/kg、Ovx+KA(轻度和重度)、Ovx+EB25ug/kg+KA(轻度和重度)、Ovx+EB2mg/kg+KA(轻度和重度)组。用高效液相色谱(HPLC)测定各组实验大鼠海马的兴奋性氨基酸(Glu和Asp)及抑制性氨基酸(GABA和Gly)水平。 结果：1)小剂量和大剂量EB预处理的去势非致痫大鼠海马组织Glu和Asp水平均显著下降，对抑制性氨基酸GABA和Gly几乎不产生影响；2)去势动物无论是否给予EB预处理，癫痫发作均诱导了海马抑制性氨基酸的显著增加，而兴奋性氨基酸改变不明显；3)EB预处理对未致痫和致痫动物的海马组织氨基酸类神经递质均产生了影响，对未致痫动物的影响是降低兴奋性氨基酸，对致痫动物的影响是在诱导兴奋性氨基酸的合成的同时，更诱导了抑制性氨基酸的合成。 结论：癫痫发作是导致早期去势大鼠海马GABA和Gly水平升高的主要原因，EB预处理对未致痫和致痫动物海马氨基酸类神经递质有不同的影响，小剂量EB对癫痫造成的海马损伤可能具有保护作用。 三.雌激素预处理对去势大鼠致痫前后血清雌二醇水平和海马组织雌激素β受体表达的影响 目的：分析不同剂量雌激素预处理的去势大鼠致痫前后血清E2和海马组织雌激素β受体(Erβ)的水平，探讨E2、Erβ与癫痫发作的相关性。 方法：将去势大鼠随机分为对照组(Ovx组)、不同剂量EB干预组(Ovx+EB)、致痫组(Ovx+KA)和不同剂量EB预处理致痫组(Ovx+EB+KA)。分别利用电化学发光法与免疫印迹法检测血清雌二醇(E2)浓度与海马组织雌激素β受体(Erβ)表达水平的变化。 结果：1)除小剂量EB(25ug/kg)预处理的去势大鼠血清E2水平(88.8±3.23pmol/L)与Ovx组(88.49±8.31pmol/L)无统计学差异外，其余剂量EB预处理((≥)EB1mg/kg)的各组去势大鼠血清E2浓度均明显高于Ovx组，且E2水平随EB的增加而增高，但不影响去势大鼠海马组织Erβ的表达。2)癫痫发作早期不仅降低了癫痫动物血清E2的水平，也降低了海马组织Erβ的表达，后者与癫痫发作的程度无关。3)小剂量EB预处理的致痫鼠海马组织Erβ的水平与致痫前并无明显差异(p＞0.05)，显示其能有效抑制癫痫发作造成海马Erβ的减少。 结论：去势大鼠海马Erβ的表达水平主要与癫痫发作有关，小剂量雌激素能有效抑制癫痫发作造成海马组织Erβ的减少。 第三部分雌激素预处理对KA致痫去势大鼠海马基因表达谱的影响 目的：分析雌激素预处理的去势大鼠经海人藻酸诱导癫痫发作后海马基因表达谱，探讨雌激素对癫痫发作大鼠海马的影响。 方法：应用含有10，000个基因的cDNA芯片，分析EB干预与否的KA诱导去势大鼠海马组织基因表达图谱。应用功能富集分析，筛选有统计学差异的基因功能群。结果：EB逆转了去势大鼠KA致痫后有显著差异表达的基因共392个，其中有151个基因功能明确。EB组与KA组相比，功能明确的基因下调的有130个，上调的有21个。经功能富集分析，共筛选出8个主要功能群，其中下调的功能群5个(21个基因)，主要涉及凋亡、抗凋亡与神经发生、长时程突触传递增强效应等，上调的有3个(4个基因)，涉及细胞膜受体相关的信号转导等。 结论：EB能逆转去势大鼠KA诱导的痫性发作后海马神经元的基因表达，可能以促进神经元凋亡为主。 收起