中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] Magwanga Richard Odongo 中国农业科学院 2019年博士导师: 王坤波共302页

摘要 : 本研究采用一个棉花种间杂种BC2F2的回交自交系群体，进行干旱胁迫处理以及基因型测序(GBS)和分型，定位了耐早的数量性状位点(QTLs)。在稳定的QTL区域内进一步挖掘基因，在干旱条件下评价基因的功能。参考陆地棉[(AD)1]、亚洲棉(A2)和雷蒙德氏棉(D5)... 展开本研究采用一个棉花种间杂种BC2F2的回交自交系群体，进行干旱胁迫处理以及基因型测序(GBS)和分型，定位了耐早的数量性状位点(QTLs)。在稳定的QTL区域内进一步挖掘基因，在干旱条件下评价基因的功能。参考陆地棉[(AD)1]、亚洲棉(A2)和雷蒙德氏棉(D5)基因组测序数据，对NLP、LEA、TH、CDK、CYP450和Alba等基因家族进行了全基因组鉴定分析;对各个基因家族中的部分新基因进行了克隆，转化到拟南芥或陆地棉中进行了干旱和盐胁迫或缺氮条件下性状鉴定，通过正向和反向遗传学手段分析了它们的功能。 1.BC2F2群体的耐早QTL定位采用自陆地棉和毛棉种间杂交的BC2F2群体的188个系，构建了一个含有10888个SNP标记的遗传图谱。图谱全长4191.3cM，平均标记距离0.1047cM，覆盖At和Dt两个亚基因组各约51％和49％。该图谱包括30个稳定的耐旱QTLs，其中有3个成簇分布（簇1、4和10），在每条染色体含有1个位点以上的簇被认为是主要的QTL簇。QTLs位点在At亚基因组略多（17个）在Dt亚基因组较少（13个）。在图谱中与耐旱生理性状相关的GBS标记紧密区域挖掘到89个基因，其大多数有内含子，只有17％（15个）基因无内含子。这些基因参与所有GO的三种功能注释。RNA测序分析，发现了与非生物胁迫相关的miRNA，如已知与NAC、MYB基因相关的miR164，在提高植物耐早性方面具有重要作用。通过RT-qPCR发现了参与增强棉花耐旱性的关键基因5个。 2.六个基因家族的全基因组鉴定以全基因组测序的3个棉种陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉分别代表棉属的AD、A和D三个基因组，用其全基因组数据鉴定了以下6个基因家族:(1)LEA基因，数量分别为242、136和142，被分为8个亚家族。AD基因组中LEA基因内含子较少，并分布于所有染色体。大多数复制的LEA基因是片段性的。共线性分析表明，较高比例的LEA基因是保守的。片段复制在棉花LEA基因的扩增中起关键作用。8个亚家族中LEA2最为丰富，具有疏水性，并进一步分为6个亚组，分别为亚组1～6。系统发育树分析揭示了棉花基因组内LEA基因家族的直系同源基因是成对的。(2)CDK，数量分别为31、15和12，分布于AD、D和A基因组的15、10和9个连锁群上。所有CDK基因被分为6个亚家族。(3)三螺旋转录因子(TH)，在AD、A和D基因组中数量分别为102、51和51。(4)CYP450，在AD、A和D基因组中分别有672、374和379个。在四倍体棉花(AD)中，CYPs基因分布在所有26条染色体上，但主要集中在Ah05和Ah12，以及它们在A和D基因组中的同源染色体。(5)Alba，在AD、A和D基因组中数量分别为33、17和20，编码的蛋白质长度范围由62aa至312aa，分子量(MW)范围为7.003kDa至34.55kDa，总平均亲水性(GRAVY)值为-1.012至0.609，等电点(pI)值为-3至11。(6)NLP，分别有105、61、60个位于AD、A和D基因组，编码蛋白长度由63aa至1，403aa，MW为7kDa至152kDa，pI为4至10，GRAVY值范围为-1至0，具有亲水性。 3.LEA和Alba基因家族的Cis调控元件、miRNA预测和GO分析发现63个miRNA靶向89个基因，如miR164、ghr-miR394等。GO分析表明，LEA基因参与干旱和防御反应。发现类似的miRNA靶向其它基因家族成员，例如Alba基因，gra-miR8770靶向4个基因，gra-miR8752和gra-miR8666靶向3个基因，gra-miR8657a、b、c、d、e各靶向10个基因，而其余则靶向1至2个基因。此外，几乎所有LEA基因的启动子区域都含有ABRE、MBS、W-Box和TAC-elements，已知它们功能上参与干旱和其它胁迫响应。在其它功能基因家族中观察到同样现象。最后，GO揭示了所有三个基因注释，分子功能、生物学过程和细胞组分，表明这些基因家族编码的蛋白在增强植物非生物胁迫耐受性方面发挥不可或缺的作用。 4.RNA和RT-qPCR验证不同基因家族编码的蛋白表达谱分析表明，多数LEA、LEA2、CDK、TH、CYP450和NLP基因在干旱和/或盐胁迫条件下有高表达。此外，与干旱敏感性品种陆地棉相比，LEA基因在野生种毛棉中的表达水平较高。干旱胁迫下，耐旱性基因型比陆地棉品种具有更强的基因调控能力。这一发现为旱作条件下陆地棉LEA基因及其在植物中可能的功能提供了全面分析的信息基础。在各基因中，有部分基因特异的高度上调，Cot_AD24498(LEA2)、Gh_D12G2017(CDK)、Gh_A05G2067(TH)，CYP450和Alba各有两个基因，Gh_D07G1197和Gh_A13G2057(CYP450)，以及Gh_D01G0884和Gh_D01G0922(Alba)。这些基因在拟南芥和棉花中分别通过正向和反向遗传得到进一步的功能鉴定。 5.干旱/盐胁迫下五个基因家族的功能鉴定转化基因Cot_AD24498(LEA2)、Gh_D12G2017(CDKF4)和Gh_A05G2067(GT-2)在拟南芥中的过表达，揭示了它们在提高植物非生物胁迫耐受性方面的意义。LEA2基因的过表达表明，参与了促进根系生长，进而具有耐旱性。Gh_D12G2017(CDKF4)、Cot_AD24498(LEA2)和Gh_A05G2067(GT-2)拟南芥过表达系在干旱和盐胁迫条件下表现出较高的抗氧化酶浓度，包括过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)浓度，且氧化剂水平极低。此外，细胞膜稳定性(CMS)、离体叶片水分损失(ELWL)、饱和叶重(SLW)和叶绿素含量的测定表明，转基因拟南芥对这两种胁迫因子的耐受性均高于野生型(WT)。同样，胁迫响应基因RD29A、SOS1、ABF4和CBL1在过表达系中高度上调，在野生型中显著下调。由于高水平的氧化酶，TH、CYP450、Alba和NLP沉默棉株表现出高水平的氧化损伤，且对CMS、ELWL、RLWC和叶绿素含量有负面影响。此外，所有胁迫响应基因在野生型中均呈上调趋势，而在VIGS植株中显著下调。收起

关键词 : 棉花耐旱基因耐盐基因数量性状座位定位

2. 中国农业生产中的养分平衡与需求研究

[学位论文] 刘晓永中国农业科学院 2018年博士导师: 李书田共297页

摘要 : 中国化肥消费量大、有机肥资源丰富，但有机肥养分资源数量和还田量以及农田养分的输入、输出时空分布特征尚不明确，各地区农业生产中养分需求和供给不清楚，严重制约养分资源的合理分配和高效利用以及农业的可持续发展。研究区域和国家层面上农田养... 展开中国化肥消费量大、有机肥资源丰富，但有机肥养分资源数量和还田量以及农田养分的输入、输出时空分布特征尚不明确，各地区农业生产中养分需求和供给不清楚，严重制约养分资源的合理分配和高效利用以及农业的可持续发展。研究区域和国家层面上农田养分投入/产出和平衡以及农业生产对养分的需求，把握不同区域养分资源与利用特点，可为养分资源的科学管理和分配提供战略性对策和依据。本研究采用统计数据和文献资料等，研究了1980～2016年中国秸秆、粪尿等有机肥养分的数量、区域分布和还田量，分析了农田养分投入/产出平衡的时空变化特征和规律，估算了2016年全面平衡施肥场景下我国农业生产的养分需求以及化肥需求和供给差。主要结果如下: 1)依据作物产量、草谷比、秸秆还田率和秸秆养分含量，计算不同年代各省秸秆和氮磷钾养分量及其还田利用。结果表明，与1980s相比，2010s全国秸秆及其NPK量（N+P+K）分别增长8577％和104.00％，2010s年均分别为90585.89×104和2502.11×104t，西北诸省、西藏和黑龙江省增幅明显，华北、长江中下游地区、四川盆地以及黑龙江省秸秆及其养分资源占全国2/3以上。与1980s相比，2010s全国秸秆NPK还田量增长2倍多，2010s年均为1783.23×104t，还田率为71.27％，其中N579.14×104t，P106.27×104t和K1097.87×104t，还田率分别为60.70％、77.34％和77.83％。华北、长江中下游地区、四川盆地和黑龙江省的秸秆NPK还田量约占全国的70％。 2)基于畜禽年末存栏数、年内出栏数、饲养周期、排泄系数和粪、尿养分含量，计算不同年代各省畜禽粪尿量、粪尿养分及其还田利用。结果表明，与1980s相比，2010s全国畜禽粪尿量及其NPK量(N+P+K)分别增长5335％和6228％,2010s年均分别为423529.66×104（鲜基）和409576×104t，东北地区增幅最大。畜禽粪尿NPK还田量从1980s年均1132.71×104增加到2010s年均1713.33×104t，河南、四川、内蒙古、山东、河北、湖南、新疆、广西、云南和安徽的畜禽粪尿NPK还田量约占全国的55.02％～59.66％。2010s畜禽粪尿N、P和K年均还田量分别为617.99×104、297.81×104和797.53×104t，还田率分别为30.58％、70.75％和48.22％。 3)我国有机肥NPK(N+P+K)资源量持续增加，2010s年均达到7797.41×104t，比1980s增加67.11％，东北地区增幅最大，河南、山东、四川、河北、湖南、内蒙古、湖北、云南、江苏和安徽有机肥NPK资源量约占全国的55.21％～57.33％。2010s有机肥N、P和K年均还田量分别为1332.69×104、437.97×104和1929.30×104t，还田率分别为35.00％、61.91％和58.78％。河南、山东、四川、河北、内蒙古、湖南、安徽、江苏、湖北和广东的有机肥NPK还田量约占全国的55.72％～60.82％。 4)基于作物产量，单位经济产量吸收养分量和秸秆还田养分量，估算了不同年代各省作物生产中养分移走量。结果表明，与1980s相比，2010s全国农田氮磷钾养分移走量(N+P2O5+K2O)增长7533％，其中N、P2O5和K2O分别增长67.03％、82.59％和84.81％，西北地区增幅最大，2010s年均移走量为3086.90×104t，其中N1497.07×104t，P2O5621.23×104t，K2O968.60×104t，河南、黑龙江、河北、江苏、四川、吉林、安徽、湖北、湖南和广东的农田养分移走量约占全国的55.66％～59.75％。 5)通过计算养分的投入（化肥、有机肥）和产出（作物移走量），得出不同年代各省养分表观平衡和偏平衡（PNB，养分移走量/投入量）。结果表明，与1980s相比，2010s全国氮磷钾养分盈余量(N+P2O5+K2O)增长208.23％，东北地区增幅最大，河南、山东、四川、湖北、河北、广西、广东、安徽、湖南、江苏和云南的盈余量占全国的56.23％～64.33％。2010s盈余5284.42×104t，其中N、P2O5和K2O分别盈余2220.36×104t、2002.27×104t和1061.79×104t。1980s到2010s PNB逐渐下降，2010s PNB-N介于0.13～0.87，东北、华北和长江中下游多数省份高于0.37;PNB-P2O5介于0.06～0.41，东北高于0.26，华北和长江中下游多数省份介于0.19～0.29，其他省份低于0.20;PNB-K2O介于0.02～0.85，东北和华北大多数省份高于0.53，其他多数省份介于0.3～0.6。 6)按2016年农作物、林地、草地、水产养殖面积和平衡施肥量，全面平衡施肥场景下全国氮磷钾养分(N+P2O5+K2O)的需求量为8441.80×104t，其中N3758.13×104t、P2O5203596×104t和K2O2647.71×104t。粮食作物养分需求量约占全国的41.53％,其次蔬菜/瓜果占21.09％。长江中下游和华北地区的养分需求较大，河南、四川、山东、湖南、广西、河北、云南、湖北、内蒙古和江苏的养分需求量占全国的52.96％。全国化肥消费与需求差为74452×104t，其中N亏缺120.61×104t，P2O5过量474.78×104t，K2O过量390.35×104t，华北地区过量最多，特别是河南、山东、河北过量较多，而西北和西南地区的多数省份化肥投入不足。收起

关键词 : 农业有机肥养分平衡化肥需求供给差

3. 中国城乡居民食物消费及营养发展研究

[学位论文] 李哲敏中国农业科学院 2007年博士导师: 唐华俊共265页

摘要 : 未来一段时期,是我国建设全面小康社会的重要阶段,也是合理引导食物生产、调整食物消费结构、进行营养干预的关键时期.在未来食物发展不容乐观、食物消费增长不可逆转、城乡居民食物消费差异日益扩大等严峻形势下,如何加强这方面的研究和引导,使之适应... 展开未来一段时期,是我国建设全面小康社会的重要阶段,也是合理引导食物生产、调整食物消费结构、进行营养干预的关键时期.在未来食物发展不容乐观、食物消费增长不可逆转、城乡居民食物消费差异日益扩大等严峻形势下,如何加强这方面的研究和引导,使之适应我国的国情和经济发展水平,是一件关系到我们进行现代化建设采取什么样的方针、政策及其事业成败的大事.基于此,本研究以食物消费理论、膳食平衡理论等为指导,开展中国城乡居民食物消费与营养发展研究.主要研究内容包括: 食物消费与营养发展研究的相关理论:分析研究居民食物消费与营养发展的理论基础;分析趋势外推法、指数平滑法等在经济学中运用,为居民食物消费与营养发展趋势预测寻求方法支撑.研究统计分析对回归方程的检验意义.依据中国农业产业结构调整的发展阶段,编制不同时期主要食物消费与营养素转换表. 食物消费与营养发展的主要模式:依据动物性食物、植物性食物占食物消费与营养结构的比例变化,将不同国家食物消费与营养发展模式划分为三大类型,分析它们的优缺点,总结合理食物消费与营养结构模式的构成,并对中国合理食物消费与营养模式及其特点进行研究.在此基础上,选取一定的指标,将中国居民食物消费与营养发展的历史进程划分为四个阶段,比较不同阶段的特点. 中国城乡居民食物消费与营养发展比较分析:从城乡居民生活水平、食物消费量及其结构,以及能量、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质等指标比较分析中国城乡居民食物消费与营养发展的变化.分析结果显示,我国城乡居民食物消费与营养发展存在着一定的差异,城镇居民的食物消费与营养结构是农村居民结构变化的先导,两者均偏离了合理食物消费与营养结构模式,需要进一步地加以引导. 城乡居民食物消费与营养发展未来趋势预测:借助SPSS软件,利用不同计量经济模型,预测城乡居民食物消费与营养发展的未来发展,对预测结果进行统计检验;就不同的合理的预测结果进行比较分析,分析在无任何干预措施的条件下,中国城乡居民食物消费与营养结构到2010、2015、2020年时的发展状况.结果显示,城乡居民的膳食营养结构仍与合理膳食营养结构存在着一定的差距.农村居民差距扩大,城镇居民有所改善. 影响居民食物消费与营养发展的主要因素:研究发现,食物供给水平、社会发展水平、和经济发展水平是影响居民食物消费与营养发展的主要因素,其中一个地区的食物种类、数量等供给水平的高低是决定居民食物消费与营养发展的最基本的物质基础,决定基本的食物消费与营养结构取向;居民收入、积累与消费比例、收入分配结构、食物零售价格等是引导食物消费与营养发展、逐步缩小区域差别的关键因素. 实现城乡居民合理消费模式的政策建议:依据以上研究结果,从国情出发,本文提出促进城乡居民食物消费与营养发展朝合理膳食结构模式转变的八大政策建议. 收起

关键词 : 城乡居民食物消费食物消费结构膳食营养结构消费模式政策建议

4. 小地老虎性信息素通讯的分子和细胞机制

[学位论文] 谷少华中国农业科学院 2013年博士导师: 郭予元共258页

摘要 : 取食、求爱及交配对昆虫来说是最基本和重要的生命活动，昆虫主要通过表达嗅觉蛋白的触角来检测环境中与生存和生殖相关的化学信号。性信息素分子和植物挥发物通过触角表皮上的极孔进入触角感器。一旦性信息素分子和植物挥发物进入到触角感器淋巴液，... 展开取食、求爱及交配对昆虫来说是最基本和重要的生命活动，昆虫主要通过表达嗅觉蛋白的触角来检测环境中与生存和生殖相关的化学信号。性信息素分子和植物挥发物通过触角表皮上的极孔进入触角感器。一旦性信息素分子和植物挥发物进入到触角感器淋巴液，触角表达的结合蛋白(包括气味结合蛋白OBP和化学感受蛋白CSP)捕获外界的化学信号分子，然后将这些信号分子运输通过水溶性的触角感器淋巴液，最后将这些化学信号分子运送至嗅觉受体神经元ORN树突膜上与化学感受受体(包括ORs和IRs)结合，紧接着气味分子被气味降解酶迅速降解掉。昆虫对性信息素具有极高的敏感性和特异性，我们可以利用这个特点在害虫综合治理中利用性信息素来进行害虫种群的监测和大量诱捕。阐明昆虫嗅觉识别的机制可以帮助我们设计新的方法来进行害虫治理。小地老虎(鳞翅目:夜蛾科)是世界范围内多种作物上的重要害虫。研究表明小地老虎雄蛾对雌蛾释放的性信息素具有极高的趋性。但是雄蛾识别性信息素的分子和细胞机制目前还不清楚。小地老虎触角中嗅觉相关蛋白的鉴定以及功能分析将有利于我们阐明昆虫嗅觉识别的分子和细胞机制。更重要的是，可以为我们提供新的方法如通过干扰昆虫嗅觉识别，进而达到对靶标害虫进行有效防治的目的。在本论文中，通过二代转录组测序，我们从小地老虎的触角中鉴定了一系列嗅觉识别相关基因，在小地老虎雌蛾性腺中鉴定了数种参与小地老虎性信息素合成、运输和降解的基因。我们对小地老虎触角中的三类嗅觉蛋白进行了系统的功能研究，包括性信息素结合蛋白PBPs、性信息素受体PRs和感觉神经元膜蛋白SNMPs,最终在转录水平、蛋白水平和细胞水平证明小地老虎PBPs、PRs和SNMPs在小地老虎识别性信息素分子中的重要作用。主要研究结果如下： 1.小地老虎触角嗅觉感器类型和超微结构扫描电镜和透射电镜结果显示:小地老虎的雌雄触角形态呈典型的性二态型:雄蛾触角呈双栉形，雌蛾触角呈丝状。雌雄触角平均长度为12mm。在小地老虎雌雄蛾触角上至少分布着6种不同类型的嗅觉感器，分别为:毛形感器、刺形感器、锥形感器、腔锥形感器、鳞形感器和B?hm氏鬃毛。毛形感器的数量最多，并且每个感器有2-3个树突神经元；锥形感器细胞壁比较薄并且每个感器有12-25个树突神经元；腔锥形感器细胞壁有4-7个树突神经元；刺形感器没有神经元,细胞壁比较厚。 2.小地老虎触角转录组测序及嗅觉基因鉴定采用Roche公司的454GSFLX测序平台，我们对小地老虎雌雄触角进行了转录组测序，通过生物信息学分析我们从小地老虎触角转录组中鉴别了一系列嗅觉识别相关基因，并用半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR技术研究了这些嗅觉基因的组织表达图谱，主要结果如下: (1)气味结合蛋白OBP基因33个。其中30个OBP基因具有完整的开放阅读框，长度为402-759bp不等。半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示其中包括三个PBP在内的22个OBP基因(PBP1,PBP2,PBP3,GOBP1,GOBP2,OBP1,OBP2,OBP4,OBP5,OBP9,OBP11,OBP12,OBP13,OBP15,OBP16,OBP17,OBP19,OBP20,OBP21,OBP22,OBP24和OBP26)特异性或主要在雌雄触角中表达。表明在触角中特异性表达或高表达的OBP基因在小地老虎识别性信息素、定位寄主植物和寻找合适产卵位点过程中起重要作用。OBP6基因不在雌雄触角中表达，反而在性腺pheromonegland(PG)中特异性表达，与典型的触角表达的OBP基因不同，这个性腺高表达的OBP基因在识别性信息素和普通气味过程中可能起着完全不同的作用。 (2)化学感受蛋白CSP基因12个。半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示3个CSP基因(CSP8,CSP9和CSP10)在雌雄触角中表达量最高，说明这三个触角高表达的CSP基因在小地老虎嗅觉识别过程中发挥关键作用。值得注意的是，一个CSP基因(CSP2)不在雌雄触角中表达，反而在性腺PG中特异性表达，暗示性腺中表达的CSP同样能够参与性信息素的结合与运输，并且昆虫能够利用性腺特异性或高表达的CSP蛋白检测并监测雌蛾自己释放的性信息素。 (3)气味受体OR基因42个，其中包括1个非典型嗅觉受体Orco,41个典型的嗅觉受体ORs。半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示35个ORs基因特异性或主要在雌雄蛾触角中表达，其中4个ORs基因(OR1,OR3,OR4和OR14)特异性地在雄蛾触角中表达，表明这4个ORs极有可能为识别性信息素的受体PRs，在小地老虎识别性信息素过程中起关键作用。4个ORs基因(OR6,OR7,OR8和OR23)主要在雌蛾触角中表达，表明这几个基因在小地老虎雌蛾定位寄主植物和寻找产卵位点过程中发挥重要作用。 (4)离子型受体IR基因24个，其中包括两个保守的CoreceptorsIR8a和IR25a.半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示14个IR基因(IR8a,IR25a,IR21a,IR41a,IR75q.1,IR75q.2,IR76b,IR87a,IR1,IR3,IR4,IR8,IR12和IR13)主要在触角中表达，其中IR12基因特异性地在雄蛾触角中表达，表明IR12可能为识别性信息素受体。 3.小地老虎性信息结合蛋白的免疫定位及与性信息素的识别反应通过同源克隆结合RACEPCR技术克隆了小地老虎性信息素结合蛋白PBP1-3基因。并对其功能进行了系统的研究，主要结果如下： (1)三个小地老虎PBP1-3蛋白之间的序列相似性为40%。与法国小地老虎种群PBP1和PBP2序列相比，中国种群PBP1在其N端多了8个氨基酸序列，分别为MAPHPSVT.中国种群PBP2蛋白在其N端多了23个氨基酸序列，分别为MAASRWCIACLVCVLFAARSVMT.与此同时，法国种群和中国种群PBP1和PBP2蛋白在其他部位部分氨基酸也发生了变异，可能代表PBP1和PBP2蛋白在法国和中国种群小地老虎中的序列多态性。 (2)采用荧光定量qRT-PCR对三个小地老虎PBP基因在不同组织中的表达谱进行了分析，结果显示小地老虎AipsPBP1-3基因在触角中的表达量明显高于在其他组织中的表达量。同时AipsPBP1-3在味觉器官喙和下唇须中也有少量的表达。AipsPBP1-3在其他部位如头，胸，腹，足和翅中的表达量非常低。AipsPBP1-3在雄蛾触角中的表达量明显高于在雌蛾触角中的表达量，分别为雌蛾触角中表达量的2.2±0.3倍,4.5±0.4倍和2.6±0.3倍(p＜0.01)。 (3)利用制备的AipsPBP1-3多克隆抗体，采用免疫组织化学技术系统研究了小地老虎AipsPBP1-3蛋白在不同触角感器中的表达分布情况，结果显示，在雄蛾触角中，胶体金颗粒主要标记在对性信息素敏感的毛形感受器的淋巴液中，有时也标记在对普通气味敏感的锥形感受器的淋巴液中。值得注意的是，有些毛形感器淋巴液并没有被胶体金颗粒标记上。在雌蛾触角中，仅有少数的毛形感器和锥形感器被标记上，说明AipsPBP1-3蛋白在雌蛾触角中的表达量极低。其余感器如刺形感器、腔锥形感器、鳞形感器和B?hm氏鬃毛没有被标记上，说明AipsPBP1-3蛋白不在这些感受器中表达。 (4)荧光竞争结合实验结果表明小地老虎PBP1-3与荧光探针1-NPN的结合常数分别为:4.4±0.3μM,3.2±0.2μM和2.1±0.2μM.AipsPBP1蛋白同小地老虎的两种主要性信息素组分Z7-12:Ac和Z9-14:Ac有着很强的结合能力，IC50值分别为0.46±0.03μM和0.84±0.08μM.AipsPBP1同其余三种信息素Z11-16:Ac,Z5-10:Ac和Z8-12:Ac的结合能力较弱。AipsPBP2蛋白也同两种主要性信息素成分Z7-12:Ac和Z9-14:Ac有着很强的结合能力，IC50值分别为0.56±0.06μM和0.45±0.03μM，与此同时AipsPBP2同微量组分Z11-16:Ac也有着很强的结合能力，IC50值为0.79±0.05μM.值得注意的是,AipsPBP3只特异性的和微量组分Z11-16:Ac有很强的结合能力，IC50值为0.62±0.04μM。 (5)双相结合实验(twophasebindingassays)得到的结果和荧光竞争结合实验的结果基本吻合。AipsPBP1蛋白结合主要性信息素成分Z7-12:Ac和Z9-14:Ac能力要明显高于其余三种微量组分Z11-16:Ac,Z5-10:Ac和Z8-12:Ac.每微克AipsPBP1能够结合Z7-12:Ac和Z9-14:Ac的量分别为2.2±0.5ng和2.0±0.5ng.AipsPBP2能够同时很好的结合两种主要性信息素组分Z7-12:Ac,Z9-14:Ac，同时也能够很好的结合微量性信息素组分Z11-16:Ac,每微克AipsPBP2蛋白能够结合这三种性信息素的量分别为1.9±0.4ng,2.1±0.5ng和2.0±0.4ng.AipsPBP3结合性信息素组分Z11-16:Ac的能力明显高于其余四种性信息素，每微克AipsPBP3能够结合Z11-16:Ac1.9±0.4ng.3个PBP蛋白中没有任何一个PBP蛋白特异性结合单一性信息素成分。 4.小地老虎性信息素受体的分子克隆及功能分析通过同源克隆结合RACEPCR技术克隆了小地老虎非典型嗅觉受体Orco和性信息素受体PR基因3个，并利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术对其在识别性信息素过程中作用深入的研究。主要研究结论如下： (1)荧光定量qRT-PCR结果显示非典型嗅觉受体AipsOrco和三个性信息素受体AipsOR1,AipsOR3和AipsOR4主要在触角中表达。AipsOrco在雌雄触角中的表达量相当(p＞0.01)。AipsOrco同时在味觉器官喙和下唇须中也有少量的表达，在足和翅中也有微量的表达，在头、胸、腹中不表达。三个性信息素受体AipsOR1,AipsOR3和AipsOR4主要在雄蛾触角中表达，其在雄触角中的表达量是在雌触角中表达量的20倍以上(p＜0.01)。三个性信息素受体同时在味觉器官喙和下唇须中也有少量表达。 (2)表达小地老虎性信息素受体的爪蟾卵母细胞对小地老虎5种性信息素呈现不同的反应图谱，性信息素受体OR3特异性识别小地老虎主要的性信息素组分Z7-12:Ac,在Z7-12:Ac浓度为10-4Mol/L的刺激下，表达OR3的卵母细胞的电流平均值能达到5100nA，性信息素受体OR1特异性识别小地老虎主要的第二主要性信息素组分Z9-14:Ac,在Z9-14:Ac浓度为10-4Mol/L的刺激下，表达OR1的卵母细胞的电流平均值为1335nA。性信息素受体OR4特异性识别小地老虎次要性信息素组分Z5-10:Ac,在Z59-10:Ac浓度为10-4Mol/L的刺激下，表达OR4的卵母细胞的电流平均值为362nA. 5.小地老虎感觉神经元膜蛋白的表达和免疫定位分析通过同源克隆结合RACEPCR技术克隆了小地老虎感觉神经元膜蛋白基因SNMP1和SNMP2，利用荧光定量qRT-PCR研究了小地老虎SNMP在成虫不同组织部位、不同发育阶段的触角以及交配前后在触角中的表达情况；利用免疫组织化学方法系统研究小地老虎SNMP在不同类型触角感受器中的表达情况。同时讨论了AipsSNMPs蛋白在昆虫嗅觉识别中的功能，主要研究结论如下： (1)荧光定量qRT-PCR结果显示AipsSNMP1和AipsSNMP2基因在雌雄蛾触角中的表达量要显著高于其在其他组织中的表达量，是在腹部表达量的100倍以上(p＜0.05)。另外，AipsSNMP1和Aip 收起

关键词 : 小地老虎性信息素结合蛋白感觉神经元膜蛋白性信息素

5. 棉花氮素高效利用的生理和分子机制研究

[学位论文] Asif Iqbal 中国农业科学院 2020年博士导师: 宋美珍共256页

摘要 : 氮是植物生长发育所必需的大量营养元素，对作物产量和品质的形成具有关键作用。棉花是重要经济作物之一。但是，肥料成本特别是氮肥成本高，是棉花种植者面临的重要问题之一。筛选高氮肥利用率棉花材料，研究其高氮肥利用率的生理机制和分子机制，从... 展开氮是植物生长发育所必需的大量营养元素，对作物产量和品质的形成具有关键作用。棉花是重要经济作物之一。但是，肥料成本特别是氮肥成本高，是棉花种植者面临的重要问题之一。筛选高氮肥利用率棉花材料，研究其高氮肥利用率的生理机制和分子机制，从而培育氮高效的棉花品种，是从根本上解决上述问题的有效途径之一。目前，在棉花氮高效研究方面，不同氮效率基因型棉花的氮素高效利用的生理机制和分子机制研究报道较少。本研究在前期筛选得到氮高效和氮低效棉花品种的基础上，研究在不同氮水平下根系构型、功能叶光合特性、功能器官碳氮代谢同化物质含量及其酶活性、关键基因介导的共表达调控网络的变化规律，以期揭示棉花氮高效的生理和分子机制，为棉花生产中利用育种手段和栽培措施改善提高棉花的氮素利用效率提供理论依据。现将取得的主要结果概括如下：以6种不同氮效率基因型棉花品种为材料，研究了在不同氮水平下棉花苗期生长发育和氮素代谢等性状。发现不同氮效率基因型的棉花品种地下部相关性状与氮素利用效率（NUtE）呈正相关，而地上部性状和氮同化酶与氮素吸收效率（NUpE）呈正相关。在正常氮（2.5mM）条件下，氮高效基因型棉花品种表现出较高的氮素利用效率（NUtE）相关性状值，在氮代谢各个同化酶中，发现谷氨酰胺合成酶活性差异显著，表明在正常氮条件下，地上部氮含量、NUtE可用作为不同基因型棉花品种间NUE的鉴定指标。在低氮（0.25mM）条件下，氮高效基因型棉花品种表现出较高的氮素吸收效率（NUpE）相关性状值，在各个生长发育和氮效率的指标中，根系表面积，根部可溶性糖含量差异显著。表明在低氮条件下，根系表面积、地上部干物重、NUpE可用作为不同基因型棉花品种间NUE的鉴定指标。以氮高效基因型棉花品种（CCRI-69）和氮低效棉花品种（XLZ-30）为材料，研究了在不同氮水平下棉花花铃期功能叶光合特性和碳氮代谢等性状。发现不同氮效率基因型棉花品种功能叶的光合特性、碳氮代谢与NUE呈正相关。同氮低效基因型棉花品种相比，氮高效基因型棉花品种功能叶的光合特性在低氮和正常氮下差异较小，说明能够在低氮下维持较为稳定的光合作用可能是棉花氮高效重要的生理机制之一。在低氮条件下，氮高效基因型棉花品种和氮低效基因型棉花品种间功能叶的氮含量没有显著差异，但是功能叶中蔗糖和果糖等非结构性碳水化合物的含量以及蔗糖合成酶（SPS）活性差异显著，说明合理的碳氮代谢和物质分配也是棉花氮高效重要的生理机制之一。以氮高效基因型棉花品种（CCRI-69）和氮低效棉花品种（XLZ-30）为材料，构建了不同氮效率棉花品种响应氮素的表达谱。研究发现，氮高效基因型棉花品种中有关营养转运蛋白、光合作用、抗氧化剂、植物激素和转录因子的基因的表达量显著高于氮低效基因型棉花品种。基因共表达网络分析表明，在低氮下根部高表达的转录因子WRKY和AP2/ERF以及地上部高表达的AP2/ERF和MYB等基因为调控棉花氮效率的中枢基因，这些基因的表达调控模式及互作网络可能是棉花氮高效重要的分子机制之一。收起

关键词 : 棉花氮素利用根系构型光合特性碳氮代谢酶活性基因调控

6. 草地螟对温湿度变异的适应与反应

[学位论文] 唐继洪中国农业科学院 2016年博士导师: 罗礼智共241页

摘要 : 草地螟Loxostege sticticalis L.(鳞翅目：野螟科)在我国主要分布于华北、东北和西北（三北）地区，1949年以来已3次26年暴发成灾，曾造成巨大的经济损失，是当地农牧业生产的重大害虫。为了阐明草地螟的发生危害规律，改善和提高草地螟的预测和控制技... 展开草地螟Loxostege sticticalis L.(鳞翅目：野螟科)在我国主要分布于华北、东北和西北（三北）地区，1949年以来已3次26年暴发成灾，曾造成巨大的经济损失，是当地农牧业生产的重大害虫。为了阐明草地螟的发生危害规律，改善和提高草地螟的预测和控制技术水平，减少草地螟的灾害损失提供实验依据，本文针对草地螟已有研究中存在的关键问题，运用生理生态相结合的原理，室内外相结合的方法，以及现代研究技术如地理信息系统（GIS），最大熵（Maxent）模型的应用，研究了温湿度对草地螟生长发育、存活、迁飞和生殖的影响作用，揭示了温湿条件与草地螟田间种群动态规律和暴发成灾的关系，预测了我国未来草地螟的发生危害趋势。获得了一些原创性结果，主要的为： 1、研究明确了温湿度对草地螟卵和幼虫存活的、幼虫所经历的温湿度条件对飞行和生殖的，以及幼虫和成虫期同一温湿度条件下饲养的草地螟的相关生命表参数的影响。通过对4个温度（18、22、26及30℃）和5个湿度（20%、40%、60%、80%及100%）组合条件下草地螟卵和幼虫存活率、以及由经不同温湿度处理的幼虫所羽化成虫体重、飞行与生殖等指标的研究，发现： 1）温湿度对卵、1~2龄和整个幼虫期的存活率均有显著的影响，而对3~4龄幼虫的存活影响不显著。5龄幼虫仅受湿度的影响，而不受温度的影响。其中以22℃和60%~80%RH条件下的存活率最高，30℃和20%RH条件下的最低。另外，幼虫发育历期随温度的升高而缩短，受温度的影响显著，但不受湿度的影响。 2）幼虫经不同温湿度处理后的虫茧历期和成虫体重差异显著。其中发育历期随温湿度的增加而缩短，而成虫体重则随温湿度的增加而下降。成虫飞行及生殖能力与其幼虫所经历的温湿条件密切相关。其中生殖能力以22℃和60%~80%RH条件下的最强，主要表现为产卵前期短，产卵量大，而以30℃条件下的最差。但是，飞行能力则以18℃和20%~40%RH条件下的最强。这些结果表明幼虫期温湿度不仅会影响草地螟幼虫的存活与发育而且还会影响到成虫的迁飞和生殖。 3）在研究明确了以不同温湿条件下饲养的草地螟在发育、存活以及生殖能力差异的同时，揭示了幼虫和成虫期均在同一个不同温湿条件下主要生命表参数的变异。其中净增长率(R0)、内禀增长率(rm)和周限增长率(λ)均以22~26℃，60%~80%RH条件下的最大，而平均世代周期(GT)和种群倍增时间(DT)也以22~26℃，60%~80%RH条件下的最短。 2、研究明确了成虫所处温湿条件对草地螟迁飞和生殖的影响作用。应用上述温湿条件对同一环境条件饲养出来的成虫飞行和生殖能力进行研究的结果表明： 1）飞行温湿条件对成虫的飞行能力有显著的影响，应用吊飞测试系统进行测试的结果表明，在18~22℃，60%~80%RH条件下成虫的飞行能力最强，而在其他温湿条件下，成虫的飞行能力较弱。另外，在最适宜的温湿条件下，成虫飞行后的能源物质含量稍低，体重消耗最小，能源物质利用效率最高。最后，飞行后的成虫生殖能力与对照的没有显著差异。但是，应用昆虫自主飞行系统对成虫飞行活动测定所得的结果则有所不同，成虫在22℃和60%~80%RH条件下的飞行活动较少，而在其他温湿条件下较多。这些结果为继续阐明草地螟的迁飞行为规律提供了重要的实验依据。 2）成虫所处的温湿条件对成虫的产卵前期、交配次数、产卵量、成虫寿命以及卵孵化率也有显著的影响。其中生殖能力和孵化率以22℃，60%~80%RH条件下的最高，在其他温湿条件下的较低。另外，成虫寿命在低温条件下较长，高温条件下较短。 3、研究明确了温湿度是影响草地螟田间种群动态规律及暴发成灾的关键环境因子。 1）通过对国内田间60起迁出和136起迁入事件的发生与温湿条件进行分析的结果表明：成虫迁出日的温度仅有5%处在21~23℃，而成虫迁入地这一比率为35.35%，两者差异显著，其他不利于草地螟生殖的因子迁出事件较迁入多，这可能是草地螟种群迁出的原因。 2）研究确定了越冬虫源存活的适宜温湿条件，比较了山西大同、内蒙古四子王旗和河北康保三地草地螟大发生周期与间歇周期之间越冬期间的温湿条件，发现大发生周期内有利于幼虫越冬的温湿条件显著优于间歇周期的。 3）通过对康保30年田间1代幼虫发生程度与越冬代成虫发生期期间的温湿度或降雨量的关系分析，发现蛾峰期7天内的温湿条件与幼虫发生程度显著相关：在成虫发生量相似的条件下，满足气温21~23℃，湿度40%~80%的天数越多，当地幼虫的危害程度越重。 4）通过分析2008年8月一代成虫、二代幼虫的发生分布与同期温湿度环境的分布特征表明：一代成虫与二代幼虫主要分布在温度为18~26℃，相对湿度>40%的区域，其中，相对湿度60%~80%的区域最为密集。成虫、幼虫的分布都为聚集型。 5）2009年我国一代幼虫的发生危害面积（400万公顷）远远低于越冬虫源面积（1600万公顷），比例严重失调。究其原因，主要的是：越冬幼虫发育期间（4月）温度的升高，促使成虫提前羽化；成虫盛发期间温湿条件明显降低，抑制了成虫起飞和生殖等活动的发生。 4、根据上述研究结果和全球气候变化数据，应用 Maxent模型预测了我国未来草地螟越冬场所的变化规律。为了阐明全球气候变化条件下我国草地螟越冬区的变化规律，本文以1949年以来我国草地螟越冬场所为基础，结合政府间气候变化专门委员会（IPCC）第五次评估报告发布的BCC-CSM1.1气候模式数据的应用，采用Maxent模型预测了4种（RCP2.6,4.5,6.0和8.5）气候变化情景下2050s及2070s年代我国草地螟越冬区的变化趋势。所得的主要结果为： 1）训练数据集和测试数据集的AUC值分别为0.989和0.987，表明模型的预测效果很好。 2）经Jackknife方法检验，降雨量变化方差Bio15是最重要的变量，最湿月份降雨量Bio13次之，最后为10月份降水量prec_10及年温变化范围Bio7。这些环境变量对模型的贡献率最大均超过10%，因而是模型构建最重要的环境变量。 3）在各种气候变化条件下，到2050s及2070s年代，我国草地螟的越冬区的面积和位置相对于当前都有不同程度的扩大和北移。其中最适越冬区面积为当前的1.41-2.94倍，其质心位置向北移动78.79~226.97 km。这些结果表明，我国未来草地螟越冬场所不仅面积将会扩大，而且位置还会北移。收起

关键词 : 草地螟温湿度生长发育存活特征种群动态

7. 达尔文氏棉和海岛棉遗传多样性及纤维品质转录组分析

[学位论文] Ditta Allah 中国农业科学院 2018年博士导师: 王坤波共239页

摘要 : 棉花是被称作“白色黄金”的天然纤维作物，广泛分布在亚热带到热带地区。优良种质资源是棉花遗传育种和机理研究重要材料，揭示其机理有利于新品种选育。本研究利用分子标记评价了132份新收集棉花种质材料的遗传多样。材料包括新发现的二倍体克劳茨基... 展开棉花是被称作“白色黄金”的天然纤维作物，广泛分布在亚热带到热带地区。优良种质资源是棉花遗传育种和机理研究重要材料，揭示其机理有利于新品种选育。本研究利用分子标记评价了132份新收集棉花种质材料的遗传多样。材料包括新发现的二倍体克劳茨基棉和异源四倍体棉（海岛棉、达尔文氏棉、毛棉、艾克曼棉和斯蒂芬氏棉），它们分别收集自厄瓜多尔加勒帕格斯群岛、多米尼亚共和国、美国夏威夷和威克环礁群岛等地区。基于111个表达序列标签(EST)和基因组简单重复序列(gSSR)标记，检测出382个多态性位点，平均每个SSR标记检测到3.44个多态性位点。多态性信息含量值变幅从0.08到0.82，平均为0.56。在收集到的野生棉种，遗传距离变幅从0.03到0.53，平均为0.33。采用STRUCTURE和主成分分析进行系统进化分析得到材料亚组分类结果是一致的。在供试材料中共观察到123个特有等位基因。有31个特有等位基因仅仅在艾克曼棉种被鉴定到。通过structure进行的方差分析表明总变异的49％为6个分组间的显著差异，总变异的51％为组内差异。来自于夏威夷群岛和加勒帕格斯群岛的圣克鲁兹岛的四倍体材料的遗传差异最大，FST值为0.752(p＜0.001)。包含有与遗传标记相关联未知基因yjcL的DUF891，被发现与色氨酸天冬氨酸重复的基因超家族高度相关。根据转录组测序的表达数据，yjcL关联基因Gh_A09G2500在干旱和盐胁迫后上调表达。新收集种质资源的遗传多样性、基因特性及遗传变异的存在在棉花遗传研究中具有里程碑式的意义。进一步研究根据棉花表达序列标签开发的SSR标记的特性。使用具有三个核苷酸基序的111个EST-SST多态性分子标记来评估收集自加拉帕戈斯群岛的79份材料(59份达尔文氏棉，20份海岛棉)。每对引物等位基因的变幅是1-7个，平均为2.85个。多态性信息含量值变幅从0.008到0.995，平均为0.520。大部分SSR的识别力很高，平均为0.98。在111个EST-SSRs和gSSRs中，发现有49个最优匹配标记，该结果与在海岛棉，亚洲棉和雷蒙德氏棉基因组中用BLASTx鉴定的155个基因类似。这49个标记包括9个DPLs，所有的MonCGR、MUCS0064和NAU1028和37个SWUs(D-genome)。在开花后10、15、18、21和28天，纤维发育相关的基因GOBAR_DD21902、GOBAR_DD15579、GOBAR_DD27526和GOBAR_AA04676明显地高表达。所鉴定的EST-SSR和gSSR标记可以有效地用于分离群体的功能基因定位、QTL鉴定和棉花育种中分子标记辅助选择。本研究利用达尔文氏棉×海岛棉（栽培种新海18）的F2群体构建用于基因定位的遗传图谱。利用四倍体棉花多态性基因组SSR标记，构建了包括613个标记的遗传图谱，分布在26条染色体，覆盖了棉花基因组2371.4cM，标记平均间距为9.35cM。锚定到每条染色体的标记数量为5到76，平均每条染色体23.57个标记。相比较A亚组(15.66％)，有较多的标记定位到D亚组上(83.03％)。最长的连锁群长度为143.387Cm，最短为58.430cM，平均长度为91.207cM。棉花D亚组遗传距离为1225.613cM，标记平均遗传距离为1.53cM，A亚组遗传距离为1176.29cM，标记平均距离2.949cM。在我们的遗传图谱中，在仅仅Chr.13(A13)和Chr.18(D13)一个同源染色体对被观测到。遗传图谱上有257个偏分离位点，偏分离比例为41.92％。与A亚组(7.34％)相比较，有较多的偏分离位点分布在D亚组(34.58％)上。在整个基因组的遗传图谱上检测到51个分离的热点区，且相比较A亚组，更多的分布在D基因组。在分离热点区所有的偏分离位点在同一个方向分离。该遗传图谱是第一个基于SSR标记构建的达尔文氏棉和海岛棉种间杂交遗传图谱。本遗传图谱为解析达尔文氏棉基因组结构和定位纤维发育相关的候选基因奠定了里重要的基础，也为精细图谱构建、图位克隆、进化研究、定位优异基因、分子标记辅助选择、棉花或者其他物种比较作图等更为深入的基因组研究奠定了基础。用纤维相关的转录组数据分析挖掘涉及纤维发育不同时期（开花后0、5、10、15、20、25天）的基因。一共鉴定到12748个差异表达基因。在新海18中鉴定到99220个差异表达基因，在达尔文氏棉中鉴定到75307个差异表达基因。在新海18中鉴定到较多的差异基因。有趣的是，与上文中PCC分析结果一致的是中棉所5-7和新海18在所有的纤维发育时期差异表达基因具有相似的表达模式。收起

关键词 : 棉花遗传多样性纤维品质转录组分析

8. ABC转运蛋白基因（ABC）和谷胱甘肽蛋白基因（GRX）在陆地棉盐胁迫响应中的交互作用机制

[学位论文] Waqar Afzal Malik 中国农业科学院 2021年博士导师: 叶武威共237页

摘要 : 对非生物胁迫的感知和信号转导激活植物的适应反应对植物在多变环境下的生存和生长具有重要意义。逆境下，氧化胁迫的产生，表明活性氧(ROS)对生物系统的损害与生物系统随时解除ROS毒害或修复由ROS造成的损伤之间存在不平衡状态。植物对干旱、盐碱、热... 展开对非生物胁迫的感知和信号转导激活植物的适应反应对植物在多变环境下的生存和生长具有重要意义。逆境下，氧化胁迫的产生，表明活性氧(ROS)对生物系统的损害与生物系统随时解除ROS毒害或修复由ROS造成的损伤之间存在不平衡状态。植物对干旱、盐碱、热、冷、紫外线和重金属胁迫等环境变化具有多种适应机制，包括激素平衡的调节、应激蛋白的合成、抗氧化防御机制的激活、代谢产物的积累和细胞膜的重排。耐盐性是一个复杂的性状，涉及许多基因家族的协同作用，这些基因家族具有气孔水分流失、离子区隔化、代谢调节、渗透调节和抗氧化防御等多种功能。近年来，分子生物学、基因组学、蛋白质组学和代谢组学的研究进展为植物基因调控网络系统的研究提供了新的思路。植物基因调控网络系统主要由诱导基因(环境因子和发育因子)、表达编程和调控元件(顺式元件和反式元件)、相应的生化途径和多种信号因子。谷胱甘肽氧化酶(Glutaredoxins，GRXs)是一种普遍存在的氧化还原酶，参与多种细胞过程，在氧化应激反应机制中发挥关键作用。ATP结合簇转运体构成了一个无处不在的膜蛋白超家族，负责ATP驱动的配体跨生物膜易位，这个过程对细胞生理学的正常维持起着至关重要的作用。GRXs可以与ABC转运体相互作用，使各种底物跨浓度梯度发生易位。本研究旨在探讨ABC转运体和GRX基因应对各种非生物胁迫时的结构.功能关系，并为功能验证和生化鉴定提供理论基础。此外，我们的研究还包括对盐胁迫相关的重要基因家族的全基因组调查和调控网络分析，以深入了解它们的结构、功能和进化关联。更重要的是，盐胁迫应答核心转录组分析的共表达网络、蛋白-蛋白相互作用网络和高通量蛋白建模与对接揭示了GRX和ABC基因家族的强相互作用。其中，GhABCG9与GhGRXC9基因间存在显著的交互作用，为功能基因组学研究提供了新的方向。我们研究发现，陆地棉中存在127个编码GRX蛋白的基因。系统发育分析表明，来自2个典型单子叶植物和9个双子叶植物的758个GRX基因可分为4类。通过对棉花、水稻和拟南芥保守蛋白基序的组织和序列标识的比较，这种分类结果也得到了确认。棉花GRX基因家族经历了较强的净化选择，但功能差异有限。四种棉属植物的共时性分析显示出良好的共线性关系。在表达分析中，发现大部分棉花GRX基因的表达受到不同植物激素和非生物胁迫的影响，这表明GRX蛋白在应对氧化胁迫过程中发挥着重要作用。顺式调控元件、基因富集和共表达网络分析，GhGRXC9基因在拟南芥中的过表达分析，在棉花中的VIGS分析，在烟草中的亚细胞定位以及在拟南芥中GUS启动子的活性分析，也表明了GRXs基因耐多种非生物胁迫的作用。全基因组和片段复制是GhGRX基因家族在进化过程中扩增的两个主要动力。在特定组织或环境胁迫反应中差异表达GRX基因的鉴定，为深入研究候选重要基因提供了新的途径。基于拓扑结构域、基因定位、蛋白大小、蛋白相似度和进化关系分析，陆地棉ABC转运蛋白基因家族的全基因组鉴定结果发现，320个ABC转运蛋白可分为四组(含全部结构域、含一半结构域、含四分之一结构域和只含ABC2结构域)，八个家族(ABCA到ABCG、ABCI)和12亚家族(MDR，PDR，MRP，PMP，AOH，ATH，ATM，TAP，WBC，RLI，GCN和NAP)。每个亚家族的ABC转运体结构动力学分析揭示这些基因在ATP结合和水解驱动底物易位耦合过程中的动力学和分子机制，展示了一种“结构-功能关系”。蛋白质基序和基因组组织的分析显示，在同一亚家族中存在结构和功能上的保守，但在不同亚家族中存在差异。单个小ABC基因的大量存在暗示更高的基因丢失率/产生率及功能和环境适应性的持续进化。通过对全基因组重复的研究，发现了片段重复和串联重复在棉花ABC基因家族扩增中的作用。总Ka/Ks比值表明4个棉花品种在进化过程中对ABC基因有强烈的纯化选择。此外，基因组织特异性表达谱和基于RNA-Seq数据的GhABCs共表达网络表明它们参与了多种分子、细胞和生物学过程。预测的顺式元件和基因富集结果也表明它们在底物易位、异生物解毒、抗病、极性生长素运输、脂质代谢、激素反应和非生物胁迫中的起作用。正向和反向遗传以及异源表达已经揭示了植物ABC蛋白的许多新作用。对环境刺激反应中表达差异的ABC基因的鉴定和蛋白质建模的结构进展将为未来的研究提供清晰和定性的分子基础。本研究将进一步拓展我们对棉花ABC基因家族的进化和功能的理解和认识。收起

关键词 : 陆地棉盐胁迫响应 ABC转运蛋白基因谷胱甘肽蛋白基因

9. 内蒙古草原和森林生态系统木霉菌生物多样性研究

[学位论文] Estifanos Tsegaye Redda 中国农业科学院 2018年博士导师: 蒋细良共231页

摘要 : 木霉菌是一类常见的真菌，广泛分布于世界各地，在工业和农业中具有显著的经济价值。从内蒙古自治区草原生态系统和森林生态系统采集的土壤中分离出木霉菌，然后对木霉菌种进行鉴定，并对其区域分布、生物多样性及潜在生物防治能力进行评价。主要研究... 展开木霉菌是一类常见的真菌，广泛分布于世界各地，在工业和农业中具有显著的经济价值。从内蒙古自治区草原生态系统和森林生态系统采集的土壤中分离出木霉菌，然后对木霉菌种进行鉴定，并对其区域分布、生物多样性及潜在生物防治能力进行评价。主要研究结果如下: 1、内蒙木霉菌资源多样性。2014-2016年，从内蒙古草原和森林生态系统共采集土样711份，共分离得到417个木霉菌株，采用形态学和分子鉴定相结合的方法，共鉴定出21个已知木霉种:T.cf harzianum(205),T.longibrachiatum(112),T afroharzianum(27),T koningiopsis(16),T.asperelloides(13),T.hamatum(9),T.rossicum(7),T.citrinoviride(7),Talni(3),T konilangbra(2),T.harzianum(3),T saturnisporum(1),T.crassum(2),T velutinum(2),T.guizhouense(1),T.gamsii(2)，T.sinuosum，T.atroviridis,T.koningii,T.virens and T.polysporum。其中T.cf harzianum，T longibrachiatum,T.afroharzianum，and T.koningiopsis为优势种，优势度(Y)值分别为0.1095，0.0476，0.00276和0.00058。木霉菌的种类数量，分离株的数量和优势种在不同地区之间有所不同。锡林郭勒和呼伦贝尔的多样性最高，反映在种类数最高（16种和12种）以及木霉菌株单倍型的Shannon-Wiener多样性指数最高（1.506和1.94）。结果表明，草原地区的木霉菌生物多样性因地区而异。此外木霉菌的分布因海拔高度的不同而有差异，海拔1000-1500米之间集中了最多的木霉菌菌种15（种）。木霉菌的分布因生态环境的不同而有差异，它广泛分布于草原与森林生态系统，分布最广的是T.cf.harzianum。另外，基于ITS、RPB和TEF-1α三个区间的联合序列，构建体统进化树，我们发现内蒙古的木霉菌种群中，CTCCSJ-G-HB41038、CTCCSJ-G-QT40324、XZ N236-3、CTCCSJ-G-HB40405、CTCCSJ-G-HB40039和CTCCSJ-G-HB40101菌株进化分支显示有木霉菌新种或中间种的存在。 2、内蒙木霉菌株拮抗作用多样性研究。对分离得到的21种380株木霉菌，通过平板对峙实验评价其对尖孢镰刀菌(FO)、立枯丝核菌(RS)和灰葡萄孢菌(BC)的拮抗效果。结果表明，380株木霉菌株对FO、RS和BC的拮抗作用存在差异，对FO的抑制率在10.12-70.70％之间，对BC抑制率在44.18-82.98％之间，对RS抑制率在35.07-88.07％之间。其中，有195株菌表现出很强的拮抗潜力，对FO菌丝体生长的抑制率超过50％,有319株和377株木霉菌株分别对RS和BC的菌丝生长的抑制率超过50％。并且，有47株木霉菌菌株对三种病原菌的菌丝生长的抑制率均超过50％，而且对于三种病原菌的重寄生作用大于30。此外，我们对T.cf.harzianum菌种内部的拮抗作用的多样性进行了研究分析，发现它们的进化分组与病原菌的拮抗作用间没有明显的相关性。 3、内蒙木霉菌生防作用多样性。对分离获得的417株木霉菌进行了黄瓜试管苗促生和防病研究。其中90株防治黄瓜枯萎病防效高于50％，186株有防效，但低于50％，29株无防效，112株促进发病。90株防效最好的菌株中T.cf.harzianum(T1，T2，T3，T4，T5，T6，T7，T8，T10)和T.atroviride(T9)的病害发病率最低(0％)，相对防效达100％。 4、内蒙木霉菌水解酶多样性研究。对拮抗功能评价中表现较好的30株木霉菌分别检测其不同类型的水解酶活性。所有检测的木霉菌株均产生细胞壁降解酶（几丁质酶，β-1，3葡聚糖酶和纤维素酶）。各种降解酶的酶活各不相同，结合离体实验，我们发现至少某一种降解酶的活性与木霉菌的拮抗作用直接相关，如CTCCSJ-F-KY40053(T afroharzianum)对FO(70.70％)、BS(81.09％)和RS(67.44)都具有很高的抑制作用，它的几丁质酶活性最高，另外对于β-1，3葡聚糖酶和纤维素酶活高的分离物分别是CTCCSJ-G-QT40113(T.longibrachiatum)和CTCCSJ-G-HB40457(T guizhouense)，它们分别对于FO抑制作用是54.41％和43.20％、对于BC抑制作用是78.31％和66.54％、对于RS抑制作用是71.20％和66.17％。以上结果反映了木霉菌不同菌株在降解酶活性上的多样性情况。收起

关键词 : 草原土壤森林土壤木霉菌菌种鉴定地理分布生物多样性生物防治能力

10. 小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究

[学位论文] 郭兆将中国农业科学院 2016年博士导师: 张友军共230页

摘要 : 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性昆虫病原微生物，由于其高效安全，Bt制剂已经成为世界上用量最大的微生物杀虫剂。Bt在产孢过程中产生的Cry类杀虫晶体蛋白基因也已被转入到多种重要的粮棉作物（Bt作物）中用于田间害虫防治... 展开苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性昆虫病原微生物，由于其高效安全，Bt制剂已经成为世界上用量最大的微生物杀虫剂。Bt在产孢过程中产生的Cry类杀虫晶体蛋白基因也已被转入到多种重要的粮棉作物（Bt作物）中用于田间害虫防治，在世界农业生产中发挥了重要的作用。然而，Bt制剂大量和不合理使用以及Bt作物的大面积种植不可避免的导致田间害虫的Bt抗性进化。而对昆虫Bt抗性机制认识的不足，正严重制约着Bt抗性治理和新型Bt杀虫蛋白的开发与应用，并严重威胁着转Bt基因作物的使用寿命。因此，考虑到Bt生物杀虫剂的经济和环境重要性，阐明昆虫Bt抗性分子机制对于延缓田间害虫Bt抗性进化和Bt的可持续应用具有重要的意义。小菜蛾(Plutella xylostella)是一种世界性分布的十字花科作物重要害虫，它能快速对各种杀虫剂形成抗药性，每年能在世界范围内引起40–50亿美元的巨大经济损失。而且，小菜蛾是第一个在田间被报道对Bt喷洒制剂产生抗性的害虫。因此，小菜蛾已成为研究复杂的Bt抗性分子机制的模式昆虫，特别是在最近其全基因组测序完成并公开后，这点表现的尤为明显。尽管近年来研究发现小菜蛾 Bt Cry1Ac抗性与BtR-1抗性基因座内一个 ABC转运蛋白基因(PxABCC2)的基因突变有关，但是对小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的分子机制的全面理解仍然任重而道远。在本论文中，我们以多个小菜蛾Bt敏感和Bt Cry1Ac毒素/Btk制剂抗性种群为研究对象，通过一系列昆虫毒理学、昆虫生理学、分子生物学、生物化学、分子遗传学和生物信息学等技术和方法对小菜蛾Bt Cry1Ac抗性分子机制进行了深入研究。研究结果表明，小菜蛾Bt Cry1Ac抗性与中肠钙粘蛋白基因(PxCAD)和中肠ABC转运蛋白基因(PxABCH1)无关，而是与BtR-1抗性基因座内有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号途径上游转录激活的PxMAP4K4基因反式调控BtR-1抗性基因座外的中肠膜结合形式的碱性磷酸酶基因(PxmALP)和中肠 ABC转运蛋白基因(PxABCG1)以及BtR-1抗性基因座内的ABC转运蛋白基因(PxABCC1-3)的差异表达密切相关。本研究结果对新型Bt作物的研发、害虫对Bt作物/Bt制剂抗性的田间检测与综合治理、新型Bt杀虫蛋白的开发与可持续应用均有重要的理论和实践意义。主要研究内容和结论如下：一、小菜蛾的室内饲养、抗性汰选与毒力生物测定利用实验室良好的昆虫饲养条件以及独特的甘蓝萝卜苗法形成了一整套成熟标准的小菜蛾室内大规模人工隔离饲养技术，同时，形成了标准的小菜蛾幼虫 Bt抗性汰选和毒力生物测定方法。毒力生物测定结果显示，与Bt敏感小菜蛾种群相比，所有4个抗性小菜蛾种群对Bt Cry1Ac毒素/Btk制剂均形成了较高的抗性水平，为后续功能实验的开展提供了良好的供试虫源。二、Bt Cry1Ac毒素与小菜蛾中肠BBMV蛋白结合分析利用Western Blot技术对Bt Cry1Ac活化毒素与小菜蛾中肠BBMV蛋白的结合情况进行半定量分析，结果表明，所有Bt抗性小菜蛾种群中肠BBMV与Cry1Ac活化毒素的结合水平显著性降低，这表明这些 Bt抗性小菜蛾种群的中肠受体发生变化（受体基因突变或表达量改变）是其对Bt产生抗性的主要分子机制。三、小菜蛾中肠CAD基因与Bt抗性的关系研究通过对小菜蛾Bt敏抗种群中肠PxCAD基因的全长cDNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现，该基因并未在 Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后，利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对PxCAD基因表达量进行分析后发现，小菜蛾Bt敏抗种群间该基因的转录水平并没有显著性差异。RNA干扰(RNAi)实验结果表明PxCAD基因表达量降低并不影响小菜蛾敏感种群幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性。而且，遗传连锁实验证实PxCAD基因与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状并不连锁。因此，小菜蛾中肠PxCAD基因与Bt Cry1Ac抗性分子机制无关。四、小菜蛾中肠ALP基因与Bt抗性关系的研究测定小菜蛾Bt敏抗种群的中肠BBMV样品中ALP和APN的酶活力后结果显示，与Bt敏感小菜蛾种群相比，所有Bt抗性的小菜蛾中肠BBMV样品中ALP酶活力均显著性降低，而APN的酶活力没有显著性变化，这表明小菜蛾中肠ALP基因可能与小菜蛾Bt抗性相关。随后，利用RACE技术克隆了小菜蛾中肠膜结合形式的ALP基因(PxmALP)的全长cDNA序列。序列比对分析发现，小菜蛾敏抗种群间PxmALP基因序列并无稳定的突变位点。qPCR结果显示，与Bt敏感种群相比，所有小菜蛾 Bt抗性种群的 PxmALP基因在中肠组织中转录水平显著性降低。利用ELISA、免疫荧光定位和细胞毒性测定实验证实了Sf9细胞重组表达的 PxmALP蛋白可以作为Bt Cry1Ac毒素的功能性受体。RNAi实验结果表明PxmALP基因表达量降低可以导致小菜蛾幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性显著性降低。而且，遗传连锁实验证实PxmALP基因中肠表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁。因此，小菜蛾中肠PxmALP基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性分子机制密切相关。五、小菜蛾中肠ABCC1-5基因与Bt抗性关系的研究利用遗传连锁图谱定位数据、小菜蛾和家蚕全基因组数据以及小菜蛾和家蚕基因之间的遗传共线性关系成功组装了3.15Mb大小的BtR-1抗性基因座。生物信息学分析发现，BtR-1抗性基因座内含有5个ABC转运蛋白基因(PxABCC1-5)。在小菜蛾Bt敏抗种群中对PxABCC1-5基因的全长cDNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现，这5个基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后，qPCR实验结果显示，与小菜蛾Bt敏感种群相比，小菜蛾Bt抗性种群中肠PxABCC2和PxABCC3基因的转录水平显著性降低，而中肠PxABCC1基因的转录水平显著性升高。利用RNAi沉默中肠PxABCC2和PxABCC3基因的表达量后能显著降低小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性，而组合干扰PxmALP、PxABCC2和PxABCC3基因的表达量后能进一步降低其敏感性。更重要的是，遗传连锁实验证实PxABCC2和PxABCC3基因表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁，然而PxABCC1基因表达量升高与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状并不连锁。因此，小菜蛾中肠PxABCC2和PxABCC3基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性分子机制密切相关。六、小菜蛾中肠MAP4K4基因与Bt抗性关系的研究生物信息学分析后发现，BtR-1抗性基因座内还具有3个 MAPK信号途径基因，其中，PxMAP4K4基因位于MAPK信号途径上游且紧邻PxABCC1-3基因。在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长cDNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现，该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后，qPCR实验结果显示，与小菜蛾Bt敏感种群相比，小菜蛾Bt抗性种群间中肠PxMAP4K4基因的转录水平升高，表明该基因在小菜蛾Bt抗性种群中转录激活。利用RNAi沉默小菜蛾抗性种群的中肠PxMAP4K4基因的表达量后能导致PxmALP、PxABCC2和PxABCC3基因的表达量显著性升高以及PxABCC1基因的表达量显著性降低并最终重建小菜蛾抗性种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此，小菜蛾MAPK信号途径上游转录激活的PxMAP4K4基因能反式调控PxmALP和PxABCC1-3基因的表达量改变并最终导致小菜蛾对BtCry1Ac毒素产生高抗性。七、小菜蛾中肠ABCG1基因与Bt抗性关系的研究对本实验室小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据进行重新分析后发现一个全新的ABC转运蛋白基因(PxABCG1或Pxwhite)在Bt抗性小菜蛾种群中表达量显著性降低。随后，在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长cDNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现，该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后，qPCR实验结果显示，与小菜蛾Bt敏感种群相比，小菜蛾Bt抗性种群间中肠PxABCG1基因的转录水平显著性降低。利用RNAi沉默中肠PxABCG1基因的表达量后能显著降低小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。而且，遗传连锁实验证实PxABCG1基因表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁。因此，小菜蛾中肠PxABCG1基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性密切相关。八、小菜蛾中肠ABCH1基因与Bt抗性关系的研究对本实验室小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据进行重新分析后发现了另一个全新的ABC转运蛋白基因(PxABCH1)在Bt抗性小菜蛾种群中表达量发生变化。在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长cDNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现，该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后，qPCR实验结果显示，在小菜蛾Bt敏抗种群间中肠PxABCH1基因表达量并无显著性差异。利用低剂量dsRNA进行RNAi沉默中肠PxABCH1基因的表达量后并不影响小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此，小菜蛾中肠PxABCH1基因与Bt Cry1Ac抗性无关。然而，利用高剂量dsRNA进行RNAi沉默中肠PxABCH1基因的表达量后却能导致小菜蛾Bt敏抗小菜蛾种群在幼虫期和蛹期全部死亡，这表明PxABCH1基因可以作为基于RNAi害虫防治和抗性治理策略的优秀靶标基因。总之，这些研究发现并鉴定了一系列小菜蛾Bt Cry1Ac抗性相关的关键基因并揭示了一种负责调控这些关键基因表达量的全新反式信号调控分子机制。因此，该研究在国际上首次全面阐明了小菜蛾田间进化Bt Cry1Ac抗性的分子机制。收起

关键词 : 小菜蛾苏云金芽孢杆菌毒素抗性转运蛋白基因分子机制