中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 彭斐吉林大学 2022年博士导师: 牛俊奇共146页

摘要 : 葡萄糖和脂肪酸是人体主要的能量来源。葡萄糖、脂肪酸的代谢经常相互交织和调节。葡萄糖可以通过从头脂质生物合成途径转化为脂肪酸和胆固醇。过多的脂质分泌在脂蛋白中或储存在脂滴中。葡萄糖和脂质的代谢物在细胞间和细胞内动态运输，然后在特定隔... 展开葡萄糖和脂肪酸是人体主要的能量来源。葡萄糖、脂肪酸的代谢经常相互交织和调节。葡萄糖可以通过从头脂质生物合成途径转化为脂肪酸和胆固醇。过多的脂质分泌在脂蛋白中或储存在脂滴中。葡萄糖和脂质的代谢物在细胞间和细胞内动态运输，然后在特定隔室中转化为其他分子。糖脂代谢紊乱导致心血管疾病、糖尿病和脂肪肝等严重疾病。肝脏在进食和禁食期间在调节全身葡萄糖和脂质代谢方面具有核心作用。通过协调控制进出三羧酸循环（Kerb cycle）的碳水化合物和脂质通量来满足能量要求，该循环受到胰岛素和胰高血糖素的严格调节。在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶(5mC)是DNA修饰的主要形式，在发育和疾病中具有重要作用。哺乳动物基因组中大约60-80%的CpG位点被5mC修饰。5mC的主要功能包括介导基因组印记、X染色体失活、抑制转座因子和调节转录。5mC在化学和遗传上都是稳定的。DNA甲基化与肝脏代谢关系密切。DNA去甲基化酶（ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases或者ten eleven translocation proteins，TETs）的肝脏表达下调在慢性肝病中极其常见，这导致了全基因组5-mC和5-hmC水平的差异，从而导致了全基因组转录的改变。异常的DNA甲基化造成的基因表达的改变与人类疾病的发病机制有关。然而，目前DNA甲基化变化的刺激因素以及造成DNA甲基化变化的机制并不清楚，而且肝脏内去甲基化酶的作用与功能没有报道。目的：通过肝脏TETs（TET1、TET2、TET3）特异性敲除来探究肝脏DNA甲基化、去甲基化的变化与肝脏代谢的联系。方法：我们在TETsflox/flox小鼠基础上，通过应用AAV-TBG-Cre病毒在肝脏进行特异性TETs敲除，观察小鼠肝脏DNA甲基化的变化，与此同时，观察小鼠肝脏TETs敲除后，机体糖脂代谢的变化，同时观察肝脏病理和肝脏内脂肪和代谢物的变化，并通过基因组内基因表达变化的差异来分析。结果：我们应用AAV8-TBG-cre和TETsflox/flox小鼠，建立肝细胞特异性TETs敲除小鼠。AAV8-TBG-cre显著敲低了肝脏内TETs的mRNA和蛋白水平。TETs敲低后，肝细胞5hmC水平降低，DNA损伤标志物表达升高，肝细胞通过碱基切除修复（BER）来弥补TETs的功能以实现去甲基化。TETs敲除小鼠肝脏脂肪沉积增加、脂肪酸氧化降低，肝脏炎症相关表达升高，肝脏内核苷酸、脂肪代谢的中间产物均显著降低，并且改变了肝脏内的代谢物、脂质的成分比例。在机体糖代谢方面，短期TETs敲除后，肝脏的用糖效率增加，但是糖原合成或储备不足，因此到TETs敲除后期，伴随着肝脏大脂滴的形成和炎症的增加，糖耐受（GTT）较野生型变差。结论： 1.AAV8-TBG-cre能够有效敲低肝脏内的TETs，并且降低肝脏内5hmC的水平。 2.TETs是维持肝脏代谢稳态的关键分子，特别是脂质代谢。 3.TETs敲除能够破坏肝细胞DNA的稳定性。收起

关键词 : 肝脏代谢 DNA去甲基化酶 DNA甲基化 DNA去甲基化

2. 拟南芥DNA去甲基化突变体的遗传筛选和去甲基化基因的定位及分子机理研究

[学位论文] 杨洁舒南京农业大学 2018年硕士导师: 腊红桂共85页

摘要 : DNA甲基化是高等植物中一种稳定且常见的表观遗传修饰，目前对DNA甲基化机理的的认识已经比较清楚。DNA甲基化形成的方式有两种:一种是维持型的甲基化，另一种是从头开始型的甲基化。基因组DNA甲基化模式是在甲基化建立、保持和去除的动态过程中最终形... 展开 DNA甲基化是高等植物中一种稳定且常见的表观遗传修饰，目前对DNA甲基化机理的的认识已经比较清楚。DNA甲基化形成的方式有两种:一种是维持型的甲基化，另一种是从头开始型的甲基化。基因组DNA甲基化模式是在甲基化建立、保持和去除的动态过程中最终形成的。DNA去甲基化在调节沉默基因的激活、维持基因处于活跃表达状态和染色体的解聚等过程中发挥重要的作用。为了寻找新的DNA去甲基化途径中的作用因子，本研究以含有2×35S启动子驱动的LUC(Luciferase)基因的转基因亲本系(2×35S:LUC)的拟南芥Col-LUC为研究的起始材料，将此亲本系进行甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)诱变，从自交的M2代群体中筛选到了四个独立的低荧光突变系，分别被命名为rll6(Reduced LUC luminescence6)，rll7(Reduced LUC luminescence7)，rll8(Reduced LUC luminescence8)和rll9(Reduced LUC luminescence9)。本研究所获得的主要结果如下: 1.与Cok-LUC亲本相比，rll6突变体的荧光明显降低，并表现出明显不同于Col-LUC亲本的表型，如植株变矮、叶子为锯齿状、叶片颜色加深等。遗传分析结果显示rll6突变体包含一个核基因隐性突变。通过图位克隆技术把该基因定位于1号染色体的两个BAC(Bacterial Artificial Chromosome)克隆F21J9和F5A9上。全基因组重测序结果表明两个基因即AT1G24470(ATKCR2)和AT1G24706.1(THO2)(分别位于F21J9和F5A9两个BAC克隆上)发生了突变。AT1G24470基因上的突变位点位于内含子区，而AT1G24706.1基因突变则是把第24个外显子上的脯氨酸变为亮氨酸。推测AT1G24706.1突变可能是造成荧光降低的原因。rll6与已经报道的tho2突变体的发育缺陷表型非常相似，例如短花丝、短雌蕊和胚胎部分败育等。甲基化敏感酶切后-聚合酶链式反应(Methylation-sensitive enzyme digestion followed by PCR，Chop-PCR)结果显示，rll6突变体基因组中几个位点的甲基化水平明显升高。以上研究结果表明，RLL6位点很可能参与了DNA去甲基化过程。 2.rll7突变体与Col-LUC亲本相比，荧光明显降低，并表现出莲座叶数量减少，花期提前的表型。遗传分析结果显示，rll7突变体携带一个细胞核单基因隐性突变。利用图位克隆技术把该基因定位于1号染色体的两个BAC克隆T7P1与F8K4之间。基因组重测序结果表明，该区间内共有三个基因发生了突变。分别为AT1G60630.1、AT1G61310.1和AT1G61510。Chop-PCR实验结果显示.rll7突变体基因组中几个位点的甲基化明显升高。综合以上实验结果表明，RLL7位点有可能参与DNA去甲基化过程。进一步的实验将集中在哪一个基因突变负责rll7的生理缺陷及荧光降低的表型。 3.rll8和rll9是从Col-LUC系统中筛选到的另外两个低荧光候选突变株，其低荧光表型与ros1-7相似，并且该突变体的低荧光表型可以稳定遗传给下一代。遗传分析结果表明，这两个突变体均携带一个细胞核单基因隐型突变。将利用图位克隆技术把目标突变基因定位到特定的染色体区间。综上所述，本研究通过遗传筛选手段，筛选到4个荧光降低的突变体rll6-rll9，并把rll6和rll7的突变基因定位在在1号染色体的不同BAC克隆之间。基因组重测序揭示了rll6的发育表型和低荧光表型很可能是由AT1G24706.1(THO2)基因突变所造成的。本研究所获得的这些突变体材料将为进一步克隆目的基因奠定良好的基础。收起

关键词 : 高等植物 DNA去甲基化突变体去甲基化基因分子机理

3. 拟南芥DNA去甲基化突变体的遗传筛选和去甲基化基因的定位及功能研究

[学位论文] 杨柳南京农业大学 2017年硕士导师: 腊红桂共66页

摘要 : 为了完善植物DNA去甲基化的分子机制，本研究通过两种方法筛选与DNA去甲基化有关的基因，进而研究它们的功能，探索它们参与DNA去甲基化过程的分子机理。方案一:本实验以包含2×35S:LUC(LUC:luciferase)报告基因的拟南芥(Arabidopsisthaliana)转... 展开为了完善植物DNA去甲基化的分子机制，本研究通过两种方法筛选与DNA去甲基化有关的基因，进而研究它们的功能，探索它们参与DNA去甲基化过程的分子机理。方案一:本实验以包含2×35S:LUC(LUC:luciferase)报告基因的拟南芥(Arabidopsisthaliana)转基因系Col-LUC为遗传筛选的起始亲本材料，将此亲本系进行EMS(Ethylmethanesulfonate)诱变，从自交的M2代群体中筛选到了一株低荧光的突变体，命名为rll2(reducedLUCluminescence2)，此突变对应的野生型基因因此被命名为RLL2。与高荧光的Col-LUC亲本材料相比，rll2突变体荧光强度明显降低。在生长发育方面，rll2突变体有明显的发育缺陷，表现为植株变矮、生长势明显比Col-LUC差。遗传学分析表明，rll2突变体携带一个细胞核单基因隐性突变。图位克隆结果表明，候选基因RLL2定位于5号染色体CL506-B14M1和CL507-B6M1两个分子标记之间，这两个分子标记分别位于F5O24和T6G21两个BAC(BacterialArtificialChromosome)克隆上。Chop-PCR结果表明，rll2突变体中染色体上一些位点的DNA甲基化水平明显升高。RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)结果显示，rll2突变体中，RNA介导的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation，RdDM)途径的几个内源靶基因的表达有不同程度的降低。综合以上的研究结果表明，RLL2很可能参与了DNA去甲基化过程。方案二:本实验利用基因共表达分析方法，筛选出了与ROS1共表达的IDP1(IncreaseDNAmethylationProtein1)基因。利用Genotyping和RT-PCR方法，鉴定到T-DNA纯合插入且IDP1功能缺失的纯合突变体。Chop-PCR结果表明，idp1突变体中染色体上一些住点的DNA甲基化水平明显升高。IDP1基因组DNA(gDNA)互补实验表明，idp1突变体中甲基化升高位点的甲基化水平在gDNA/idp1-1互补株系中已经降低了或恢复到野生型水平。GUS染色结果表明，IDP1主要在子叶和花萼片中表达，在子叶中主要表达在叶脉部分。NRPD1A和RDM1是RdDM途径中重要的参与因子。通过对idp1-1/ros1-4、idp1-1/nrpd1a-3、idp1-1/rdm1-4和idp1-1/met1(Col-gl)四种双突变体的Chop-PCR分析，表明IDP1确实参与了DNA去甲基化的过程，且与RdDM途径可能存在拮抗关系。idp1-1/Col-LUC和idp1-1/C24-LUC(Col-4)双突变体的荧光和Kanamycin抗性结果表明，IDP1影响了Col-LUC和C24-LUC的35S启动子的活性。全基因组DNA甲基化测序结果表明，IDP1和ROS1在参与DNA去甲基化的过程中，在靶位点的选择上存在相似性和差异性。综合以上的研究结果表明，IDP1很可能是一种新的DNA去甲基化的调控因子，它可能与ROS1在同一个遗传途径中，但在靶位点的选择上与ROS1存在差异性。收起

关键词 : 拟南芥 DNA去甲基化 rll2突变体去甲基化基因遗传学功能

4. LSD1通过去甲基化酶活性非依赖性途径调控FBXW7稳定性和功能的分子机制

[学位论文] 蓝辉银浙江大学 2018年博士导师: 孙毅共117页

摘要 : FBXW7(F-box and WD-40domain protein7)是SCF(SKP1-Cullin1-F-box protein)E3泛素连接酶复合物中负责识别和结合底物的蛋白成分。它是目前研究得比较广泛的几个F-box蛋白之一。FBXW7通过调控其底物降解过程而参与细胞存活、增殖、分化、迁移等多种细... 展开 FBXW7(F-box and WD-40domain protein7)是SCF(SKP1-Cullin1-F-box protein)E3泛素连接酶复合物中负责识别和结合底物的蛋白成分。它是目前研究得比较广泛的几个F-box蛋白之一。FBXW7通过调控其底物降解过程而参与细胞存活、增殖、分化、迁移等多种细胞生理活动。而由FBXW7负责泛素化降解的底物绝大多数为促癌蛋白，例如c-MYC、Notch1、Cyclin E、c-JUN和MCL-1等。FBXW7基因位于染色体4q32，FBXW7的基因突变及其染色体区域删除或丢失的现象广泛存在于人类癌症中。FBXW7缺失或突变导致其功能失活后，其下游底物促癌蛋白大量积累，最终加速肿瘤的发生发展进程。已有大量研究证实，FBXW7的表达水平变化与癌症的发生发展和患者的生存预后密切相关。 LSD1(Lysine-specific demethylase1)是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶，它属于黄素腺嘌呤二核苷酸依赖型胺氧化酶超家族。LSD1通过氧化还原反应特异性地催化单甲基化或双甲基化的组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和第9位赖氨酸(H3K9)发生去甲基化。通过改变H3K4/H3K9的甲基化水平，LSD1发挥着重要的转录调控功能，在多种生理活动过程中发挥极其重要的作用，包括细胞增殖、凋亡、染色体分离、干细胞多能性调控和胚胎发育等。目的:LSD1被认为是一个促癌基因，目前针对LSD1的研究及其抑制剂的开发主要基于其去甲基化酶活性。关于LSD1去甲基化酶活性以外的功能，尚不清楚。同样的，FBXW7的研究主要集中在寻找其调控的下游底物方面，而FBXW7上游自身的被调控机制研究不多。我们的研究旨在阐述LSD1是如何通过其去甲基化酶活性非依赖性的途径在上游调控FBXW7的分子机制。以期在转化医学意义上，可以通过阻断FBXW7与LSD1的相互结合来提供一个靶向LSD1小分子抑制剂开发的新思路。方法：分别用免疫印迹(WB，Western Blotting)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR，Quantitative Real-time PCR)方法检测LSD1过表达或者敲减对FBXW7的蛋白质和信使RNA(mRNA)表达水平的影响，以此确定LSD1在翻译后水平调控FBXW7的蛋白质表达。用免疫共沉淀(Co-IP,Co-immunoprecipitation)和体外蛋白质相互作用实验(Pull down)明确FBXW7和LSD1存在直接相互作用。用蛋白质半衰期实验以及细胞内泛素化实验证明FBXW7不影响LSD1的蛋白质稳定性，反过来LSD1调控FBXW7的蛋白质自身泛素化进而影响其蛋白质稳定性。采用体内外蛋白质二聚体形成实验证实LSD1调控FBXW7的机制是通过打断FBXW7的二聚体形成而促进其自身泛素化降解。构建FBXW7的二聚体形成关键位点突变体，以及LSD1的CPD降解决定子突变体，阐明LSD1调控FBXW7依赖于二者的相互结合，而不依赖于LSD1的去甲基化酶活性。用Co-IP以及蛋白酶体抑制剂(MG132)和溶酶体抑制剂氯喹(CQ，Chloroquine)处理等方式证实泛素化的FBXW7可以与p62结合并通过p62介导的自噬溶酶体途径降解。在生物功能学的实验上，采用ATPlite、克隆形成实验、微离子辐射镭射光束实验、线性化质粒NHEJ修复实验和离子辐射增敏试验等，检测LSD1是否调节FBXW7的生物学功能。结果：我们的论文主要揭示了LSD1可以直接与FBXW7结合，并且通过其去甲基化酶活性非依赖性的途径负性调控FBXW7的稳定性。具体生化机制上，LSD1是一个FBXW7的假底物，并且FBXW7与LSD1的相互结合不催化LSD1的泛素化，反过来LSD1通过打断FBXW7的二聚体形成而促进FBXW7的自身泛素化。FBXW7发生自身泛素化之后，除了通过蛋白酶体降解之外，还可以通过p62/SQSTM1介导的自噬溶酶体途径被降解。生物功能上，LSD1通过负性调控FBXW7的稳定性而抑制其在细胞增殖、NHEJ修复和离子辐射保护等方面的作用。结论：LSD1可以作为一个FBXW7的假底物，直接结合FBXW7而通过其去甲基化酶活性非依赖性途径负性调控FBXW7的蛋白质稳定性。我们的研究揭示了LSD1之前未知的去甲基化酶活性之外的功能，且很有可能这个功能与其促癌功能有关。在LSD1相关的抗肿瘤药物开发机制上，除了靶向其去甲基化酶活性，我们的研究提示，通过靶向LSD1蛋白本身可能成为一个新的策略。收起

关键词 : 恶性肿瘤靶向治疗组蛋白去甲基化酶去甲基化酶活性 FBXW7基因调控机制

5. DNA去甲基化在拟南芥应答镉胁迫中的作用

[学位论文] 范士凯浙江大学 2019年博士导师: 金崇伟共165页

摘要 : 作物镉积累阻控措施是实现大量中低程度的镉污染土地安全生产的有效途径之一，而植物对镉的吸收积累特性以及调控机制是研发上述措施的重要理论基础。近期的研究发现，表观遗传修饰特别是DNA甲基化可能在调控镉胁迫过程中发挥重要的作用。植物体内的D... 展开作物镉积累阻控措施是实现大量中低程度的镉污染土地安全生产的有效途径之一，而植物对镉的吸收积累特性以及调控机制是研发上述措施的重要理论基础。近期的研究发现，表观遗传修饰特别是DNA甲基化可能在调控镉胁迫过程中发挥重要的作用。植物体内的DNA甲基化模式和水平主要由DNA甲基化和DNA去甲基化动态调控,但镉胁迫是如何诱导DNA甲基化变异的以及镉胁迫诱导的DNA甲基化变化对植物镉耐性的影响机制仍然不清楚。为此，本文以拟南芥为研究材料，系统研究了镉诱导的DNA甲基化变异在植物响应镉胁迫中的作用机制。主要研究结果如下：以野生型即哥伦比亚型(Col-0)拟南芥为实验材料，结合全基因组重亚硫酸盐测序技术(WGBS)技术，首先研究了镉胁迫下拟南芥DNA甲基化组的变化。镉处理(+Cd)导致植物体内DNA甲基化平均水平升高，但与CG甲基化类型相比，CHG和CHH(H代表A，C或T)甲基化类型更容易受镉影响。采用滑动窗口方法，识别到了5806个差异甲基化区域(DMRs)，均是CHG或CHH类型。进一步通过基因组注释发现大多数CHN-DMRs都与转座子重叠，其分布模式与转座子在基因组本身的分布相似，这表明镉胁迫诱导了DNA甲基化水平的增加，更偏向于CHG和CHH类型和转座子。进一步采用RNA高通量测序技术(RNA-seq)和定量PCR技术，研究了镉胁迫对主要涉及表观遗传学过程基因表达的影响，发现DNA去甲基化中的三个基因ROS1(Repressor Of Silencing 1),DML2(Demeter-like 2)和DML3的表达都被镉强烈抑制。为此，通过完全聚类分析，主成分分析和相关性系数分析对镉诱导的DMRs在Col-0和rdd突变体(ROS1,DML2和DML3功能都缺失的突变体)之间进行了对比分析。发现Col-0在+Cd下甲基化模式与rdd突变体在-Cd和+Cd下的甲基化模式均相似。上述结果表明镉诱导的DMRs与ROS1/DML2/DML3介导的DNA去甲基化的抑制有关。进而以Col-0与rdd突变体为材料，研究了镉诱导的DNA甲基化变异在植物镉耐性中的作用。在20μM或40μM的镉处理条件下，rdd突变体的生长显著优于Col-0，而加DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza)处理后，Col-0与rdd突变体生长差异变小。这表明镉诱导的基因组超甲基化有利于改善植物的镉耐性。进一步研究了ROS1,DML2和DML3在植物镉耐性中的冗余性。在40?μM镉处理条件下，单突ros1、双突ros1/dml2、ros1/dml3和dml2/dml3的生长均优于Col-0植株，但仍劣于rdd三突；而单突dml2和dml3的生长与Col-0植株无明显差异。这些结果表明ROS1,DML2和DML3在负调控植物镉耐性中存在部分冗余性，其中ROS1的贡献最大。通过分析植物组织中的镉发现，rdd突变体根部的镉浓度明显低于Col-0；而在地上部，二者之间无明显差异。另一方面，5-aza处理却增加了Col-0植物根部的镉浓度，而对地上部的镉浓度也无明显影响。这表明增加植物体内的DNA甲基化水平有利于降低根系的镉积累。进而采用非损伤微电极系统测定了根系的镉吸收速率，发现Col-0与rdd突变体之间的净镉离子吸收速率在所检测的根系部位无显著的统计学差异。同样，5-aza处理对Col-0根系的净镉离子吸收速率也无明显影响。这两方面结果显示DNA甲基化的变异可能对于根系镉离子的吸收没有作用。因此，DNA甲基化水平提高所降低的根系镉浓度不是根系镉吸收减少所致，而可能是通过增强植物镉耐性改善植物生长所形成的稀释作用来实现的。为此，研究了ROS1,DML2和DML3负调控植物镉耐性的作用机制。通过转录组测序分析发现，镉胁迫下，细胞内应答铁饥饿过程的基因表达在Col-0与rdd突变体之间存在显著差异，其中bHLH38，bHLH100，bHLH101，PYE，MTP3，IREG1，IREG2和IRT1等8个参与铁的吸收转运和稳态平衡的基因在rdd突变体的表达显著高于在Col-0中的表达。此外，rdd突变体根部的铁含量也明显高于Col-0。这表明DNA甲基化水平提高有助于改善根系的铁营养。进一步研究发现低铁(1μM)处理使Col-0与rdd突变体的镉耐性差异消除。上述结果表明根部铁营养改善是DNA甲基化水平提高改善植物镉耐性的原因。综上，镉胁迫首先抑制DNA去甲基化酶基因ROS1,DML2和DML3的表达，进而伴随全基因组DNA甲基化程度的增加。基因组超甲基化导致参与铁吸收转运和平衡过程相关基因表达水平的升高，从而通过改善植物体内的铁营养缓解镉毒。收起

关键词 : DNA去甲基化镉胁迫 WGBS技术

6. 依匹哌唑靶向KDM4A抑制胃癌生长的机制研究

[学位论文] 李昂郑州大学 2022年硕士导师: 董子钢；刘康栋共93页

摘要 : 背景和目的胃癌(GastricCancer，GC)是全球最常见恶性肿瘤之一。2020年全世界的胃癌新发患者达到约一百万，死亡患者约七十七万。胃癌在中国属于高发的癌症，我国关于胃癌的死亡病例约占世界胃癌总死亡病例的二分之一。由于胃癌病人早期多数患病... 展开背景和目的胃癌(GastricCancer，GC)是全球最常见恶性肿瘤之一。2020年全世界的胃癌新发患者达到约一百万，死亡患者约七十七万。胃癌在中国属于高发的癌症，我国关于胃癌的死亡病例约占世界胃癌总死亡病例的二分之一。由于胃癌病人早期多数患病体征不明显，不易被诊断发现，造成胃癌的早期诊断率相对低下。胃癌预后较差，进展期的胃癌病人五年生存率不到百分之二十。因此，进一步阐明胃癌的发生发展机制，寻找有效的靶点及防治药物对预防胃癌复发，降低胃癌病死率具有重要意义。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶4A(Lysine(K)-specifificdemethylase4A，KDM4A)是一种重要的表观遗传酶，通过催化组蛋白H3K9me3/H3K9me2的去甲基化，改变染色质结构，调节基因的转录。KDM4A参与多种生物过程的调节，包括细胞增殖、分化、发育和代谢，是重要的癌症治疗靶点。KDM4A的过度激活可推动肝癌细胞周期从G0/G1到S期的进展，并阻断肝癌细胞的凋亡。降低KDM4A的表达可以抑制前列腺癌的发展。然而，关于KDM4A在胃癌中的研究较少。在此，我们研究了KDM4A在GC中的作用机制及其在GC中的临床意义。从临床非抗肿瘤药物中发现抗肿瘤的新用途为抗肿瘤药物的研发提供了新思路。与研发新的抗肿瘤药物比，临床现有的药物具有庞大的临床数据，且安全性高，与研究新药所需要的药代动力学、毒性方面的研究投入的资金和时间相比大大减少。课题组前期通过对临床用药进行筛选，筛选出了能明显抑制胃癌细胞增殖的药物依匹哌唑。在本研究中，首先通过免疫组化染色方法证明KDM4A在胃癌组织中高表达，且与胃癌的预后呈负相关。通过回补实验将敲除的KDM4A进行恢复，证实KDM4A可促进体外胃癌细胞的增殖和克隆形成。通过计算机分子模拟，下拉实验和蛋白截断实验找到靶向抑制剂依匹哌唑;在体外通过增殖实验、锚定依赖性生长实验和非锚定依赖性生长实验证实依匹哌唑可抑制胃癌细胞的增殖、锚定依赖性生长和锚定非依赖性生长，通过活性实验证实依匹哌唑可以抑制KDM4A的活性，通过免疫共沉淀、DNA-FISH、qRT-PCR和Westernblot方法证实依匹哌唑可能通过抑制KDM4A/c-Myc信号通路进而抑制胃癌;进一步通过体内实验验证依匹哌唑可以抑制胃癌的生长，并利用免疫组化方法证实依匹哌唑通过靶向作用于KDM4A，抑制下游信号通路的激活。方法 1.研究KDM4A在胃癌中的表达及其与胃癌患者的临床特征的相关性利用免疫组化分析组织芯片，研究KDM4A在胃癌组织中的水平以及与胃癌预后的关系。利用TCGA数据库分析KDM4A在胃癌组织中的表达情况，以及与胃癌的临床分级的相关性。 2.研究KDM4A在胃癌中的功能利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KDM4A稳定敲除的HGC27和AGS两种胃癌细胞系。利用细胞增殖实验检测敲除KDM4A后对胃癌细胞增殖的影响。利用锚定依赖性生长实验、锚定非依赖性生长实验检测敲除KDM4A对胃癌细胞克隆形成能力的影响。通过恢复实验恢复KDM4A的表达，再利用细胞增殖实验、锚定依赖性生长实验、锚定非依赖性生长实验检测KDM4A对胃癌细胞增殖和克隆形成的影响。 3.研究临床用药依匹哌唑与KDM4A结合通过计算机分子对接模型模拟依匹哌唑与KDM4A的结合。通过蛋白下拉实验检测KDM4A与依匹哌唑之间的相互作用。将KDM4A的两个重要结构域进行纯化，利用蛋白下拉实验评价依匹哌唑与KDM4A的结合片段。 4.研究依匹哌唑抑制KDM4A/c-Myc信号通路利用表观酶KDM4A去甲基酶活性/抑制测定试剂盒检测依匹哌唑对KDM4A活性的抑制作用。利用Westernblot实验检测不同浓度的依匹哌唑对H3K9me3、H3K9me2、H3K9me1的蛋白水平的影响。利用免疫共沉淀实验检测依匹哌唑是否可以影响KDM4A与H3K9me3和H3K9me2的结合。利用qRT-PCR实验验证依匹哌唑对KDM4A的下游c-Myc转录水平的影响。利用Westernblot实验验证不同浓度的依匹哌唑对c-Myc蛋白水平的影响。利用DNA-FISH实验验证依匹哌唑和KDM4A对c-Myc的DNA拷贝数变化的作用。 5.研究依匹哌唑体外抑制胃癌细胞增殖利用细胞毒性实验检测不同浓度的依匹哌唑对胃癌细胞的毒性作用。利用细胞增殖实验检测依匹哌唑对胃癌细胞增殖能力的抑制作用。通过锚定依赖性实验和非锚定依赖性实验检测依匹哌唑对胃癌细胞的克隆形成的影响。 6.研究依匹哌唑在体内抑制胃癌生长利用患者来源的胃癌异种移植瘤(patient-derivedxenograft，PDX)模型，用依匹哌唑灌胃处理荷瘤小鼠，观察依匹哌唑在体内抑制胃癌生长的效果。利用Westernblot观察依匹哌唑处理后的肿瘤组织中H3K9me3、KDM4A、c-Myc的蛋白水平的影响。通过免疫组织化学染色检测依匹哌唑处理后的肿瘤组织中KDM4A、c-Myc、Ki-67的蛋白水平的改变。结果 1.KDM4A在胃癌组织中高表达，且与患者的预后呈负相关免疫组织芯片结果显示与癌旁组织相比，KDM4A在胃癌组织中呈现高表达，且KDM4A表达与患者的预后呈负相关。对TCGA数据库进行分析，结果显示KDM4A在胃癌中高表达，且胃癌的临床分级越晚KDM4A的表达水平越高。 2.KDM4A在体外促进胃癌细胞的生长细胞增殖实验结果表明敲除KDM4A对胃癌细胞生长能力有抑制作用。锚定依赖性实验结果表明敲除KDM4A对胃癌细胞克隆形成能力有抑制作用。非锚定依赖性实验结果表明敲除KDM4A对胃癌细胞克隆形成能力有抑制作用。构建KDM4A恢复的胃癌细胞系，其细胞增殖实验、锚定依赖性实验、非锚定依赖性实验结果表明KDM4A对胃癌细胞生长和克隆形成能力有促进作用。 3.KDM4A可靶向结合依匹哌唑计算机分子对接模型显示KDM4A能够与药物依匹哌唑相互结合。蛋白下拉实验结果证明依匹哌唑可与外源性表达KDM4A蛋白、内源性表达KDM4A的HEK293F细胞裂解液、以及HGC27和AGS胃癌细胞中的KDM4A蛋白结合。通过纯化KDM4A的含有两个重要结构域的氨基酸片段(1-360、800-1064)，进行的蛋白下拉实验结果表明依匹哌唑可与KDM4A的1-360的氨基酸片段进行结合。 4.依匹哌唑抑制KDM4A/c-Myc信号通路表观酶KDM4A去甲基酶活性/抑制测定试剂盒结果显示依匹哌唑可呈浓度和时间依赖性抑制KDM4A的活性。已知KDM4A可以造成H3K9me2和H3K9me3位点的去甲基化，通过Westernblot实验证明依匹哌唑处理后，H3K9me3和H3K9me2蛋白水平增加。免疫共沉淀实验结果显示加入高浓度的依匹哌唑可造成H3K9me3的堆积。说明依匹哌唑可抑制KDM4A对H3K9me3的去甲基化作用，从而导致H3K9me3的堆积。通过qRT-PCR、Westernblot实验结果表明依匹哌唑可呈浓度依赖性抑制c-Myc的转录水平和蛋白水平。由于KDM4A可以使c-Myc的DNA拷贝数扩增。通过DNA-FISH实验结果表明高浓度的依匹哌唑和敲除KDM4A都能够抑制c-Myc的DNA拷贝数。 5.依匹哌唑靶向KDM4A抑制胃癌细胞系的生长细胞毒性实验结果显示不同浓度的依匹哌唑对胃癌细胞存在明显的毒性作用。细胞增殖实验结果显示依匹哌唑对胃癌细胞增殖有抑制作用，且浓度越高，抑制越强。锚定依赖性实验结果显示依匹哌唑对胃癌细胞克隆形成能力的抑制作用呈浓度依赖性。锚定非依赖性实验结果显示依匹哌唑对胃癌细胞的克隆形成有抑制作用。 6.依匹哌唑在体内抑制胃癌的生长在PDX模型中，依匹哌唑处理的给药组小鼠的肿瘤体积和瘤重明显小于对照组。Westernblot结果显示，依匹哌唑处理后的小鼠肿瘤组织中的KDM4A的蛋白表达无变化，H3K9me3的蛋白表达显著升高。免疫组织化学结果显示，依匹哌唑处理后的小鼠肿瘤组织中的Ki-67、c-Myc的蛋白水平显著下降。结论 1.KDM4A在胃癌组织中高表达，且表达水平与胃癌的预后呈负相关。 2.KDM4A可以在体外促进胃癌生长。 3.依匹哌唑靶向结合KDM4A，并抑制KDM4A的活性，下调c-Myc的转录水平和蛋白水平，且使c-Myc的DNA拷贝数下降，从而降低c-Myc的表达，抑制胃癌在体内和体外的生长。收起

关键词 : 胃癌依匹哌唑赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶4A 去甲基化细胞增殖

7. Tet1在认知，情绪和社交行为中的功能研究

[学位论文] 应春草厦门大学 2022年硕士导师: 张亚霖共82页

摘要 : Tet(Ten-eleventranslocationmethylcytosinedioxygenase)蛋白全称为十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶。Tet可以将5-甲基胞嘧啶(5mC)转化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，从而实现去甲基化的过程。甲基化在发育、癌症、神经系统中都有着不可磨灭的作用。所以研... 展开 Tet(Ten-eleventranslocationmethylcytosinedioxygenase)蛋白全称为十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶。Tet可以将5-甲基胞嘧啶(5mC)转化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，从而实现去甲基化的过程。甲基化在发育、癌症、神经系统中都有着不可磨灭的作用。所以研究Tet蛋白的作用有着重要的意义。并且5hmC在大脑中含量丰富，这更加体现了Tet在中枢神经系统中的重要性。Tet1属于Tet蛋白家族中的一员，主要调控启动子上的去甲基化的过程。而内侧前额叶皮质mPFC(medialPrefrontalCortex)和基底外侧杏仁核BLA(BasolateralAmygdala)在脑中分别起着重要的作用。虽然有研究表明了在情绪方面mPFC中Tet1的变化，但是在其他功能方面却鲜有报道，对杏仁核中Tet1的相关报道也是少之又少。本课题研究的主要内容是分别在mPFC和BLA中选择性定点敲除神经元中Tet1蛋白，观察小鼠在认知（工作记忆和识别记忆）、情绪（焦虑和抑郁）、社交功能等方面的变化。首先我们包病毒获得AAV-hsyn-cre-mCherry和AAV-hsyn-mCherry这两种病毒。通过脑立体定位注射的方式在mPFC和BLA中注射AAV病毒并证明了AAV可以在脑中表达。为了研究Tet1在mPFC中作用，我们用Y迷宫、新物体识别去验证小鼠的认知功能有没有出现异常;用黑白箱、旷场、高架十字迷宫等去观测小鼠的焦虑水平;用糖水偏爱、悬尾去判断小鼠是否有抑郁样行为;用三箱社交实验去评测小鼠的社交功能。我们发现小鼠在认知（工作记忆和识别记忆）、情绪（焦虑和抑郁）都没有发生明显的变化，但在社交方面，实验组的小鼠表现出社会新颖性缺陷的表型。同样的，我们用了几乎相同的模式去研究Tet1在BLA中的作用。我们发现在BLA中敲除Tet1，不会影响小鼠的情绪样行为和恐惧记忆。综上，本研究较为全面的探索了Tet1在mPFC中的作用，并发现Tet1对小鼠的社交功能可能存在影响。同时我们也初步探索了Tet1在BLA中作用，虽然在情绪和恐惧记忆等方面都没有明显的变化，但却影响了小鼠的摄食。为今后研究Tet蛋白在大脑中的功能给予了一些启示。收起

关键词 : Tet1蛋白 mPFC BLA 行为学去甲基化

8. ZNF496与KDM2B协同降低RelA甲基化抑制宫颈癌进展的研究

[学位论文] 丁悦潍坊医学院 2023年硕士导师: 赵春玲；田春艳共82页

摘要 : 目的:炎症是一种机体遏制潜在病原体、激活修复机制并进一步限制组织损伤的反应。其中，慢性炎症可以诱发正常细胞转化为癌症。比如，宫颈癌(Cervical cancer,CC)是由慢性宫颈炎经过一系列的癌前病变演变而来的。核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF... 展开目的:炎症是一种机体遏制潜在病原体、激活修复机制并进一步限制组织损伤的反应。其中，慢性炎症可以诱发正常细胞转化为癌症。比如，宫颈癌(Cervical cancer,CC)是由慢性宫颈炎经过一系列的癌前病变演变而来的。核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)作为一个经典的炎症通路，其异常激活是促进宫颈癌发生发展的重要因素。我们实验室早期发现NF-κB的重要成员转录因子p65(RelA)和 KRAB 型锌指蛋白 ZNF496(Krüppel-associated box domain type zinc finger proteins 496,KRAB-ZFP496)存在相互作用，并证明 ZNF496 下调 RelA甲基化水平负调控NF-κB信号通路，抑制宫颈癌的发展。为了深入探究其机制，利用免疫沉淀串联质谱分析(Immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)筛选到ZNF496的另一相互作用分子赖氨酸去甲基化酶KDM2B(Lysine specific demethylase 2B,KDM2B)。KDM2B通过其去甲基化酶活性位点下调RelA甲基化水平，负调控NF-κB信号通路，抑制宫颈癌的发展。但是，KDM2B下调RelA甲基化水平的作用位点及功能，ZNF496、KDM2B、RelA三者间相互作用关系，以及ZNF496在KDM2B下调RelA甲基化水平过程中发挥的作用等问题尚未完全明确。因此本课题就ZNF496和KDM2B对RelA去甲基化的作用位点和功能进行深入研究，并对ZNF496、KDM2B、RelA三者间相互作用区域进行探讨，进一步确定ZNF496介导KDM2B和RelA相互作用的机制，为宫颈癌的预防、诊断和治疗提供新的思路。方法:首先，通过注射敲除ZNF496的宫颈癌细胞HeLa进行裸鼠皮下成瘤以及裸鼠肺转移模型实验，进一步确证ZNF496在动物体内对宫颈癌细胞的影响。之后，利用报告基因、甲基化检测、质谱等实验共同确证KDM2B抑制NF-κB的转录活性是否依赖RelA,并确定其作用位点。随后，构建稳定敲除RelA的HeLa细胞株，通过回补野生型RelA及其甲基化位点突变体进行细胞迁移、侵袭和凋亡等实验确证ZNF496和KDM2B通过RelA对宫颈癌细胞学效应产生影响的机制。之后，构建ZNF496、KDM2B、RelA的截短体，利用免疫共沉淀（Co-inmunoprecipitation,CO-IP）技术鉴定三个分子的具体相互作用区域，绘制相互作用模式图。然后，通过间接免疫荧光技术确证ZNF496对KDM2B定位的影响。最后，应用购买的组织芯片和收集的临床宫颈癌组织标本，采用免疫组织化学染色技术进行检测，并评估其临床价值。结果:（1）裸鼠皮下成瘤实验显示，ZNF496敲除的宫颈癌细胞皮下成瘤能力增强。（2）肺转移模型显示，ZNF496敲除的宫颈癌细胞的肺转移能力增强。（3）RelA敲除的HeLa细胞回补野生型RelA时，ZNF496能够抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭;回补突变型RelAK37R时，ZNF496抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭的能力减弱。（4）甲基化检测、报告基因和质谱实验确证ZNF496的互作蛋白KDM2B通过其去甲基化酶活性直接下调RelA K37甲基化，负调控NF-κB活性。（5）RelA敲除的HeLa细胞回补野生型RelA时，KDM2B能够抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭，促进宫颈癌细胞凋亡;回补突变型RelA K37R时，KDM2B抑制宫颈癌细胞迁移、侵袭的能力减弱，促进宫颈癌细胞凋亡的能力减弱。（6）截短体的CO-IP实验发现，ZNF496的C2HR区和RelA的N端相互作用，ZNF496的Linker区和KDM2B的C端相互作用，KDM2B的C端和RelA的N端相互作用。（7）在ZNF496敲除的HeLa细胞中转染KDM2B并回补野生型ZNF496及其与KDM2B相互作用区缺失的截短体，通过间接免疫荧光实验发现，ZNF496敲除时，KDM2B定位于细胞质;回补野生型ZNF496时KDM2B定位于细胞核;回补ZNF496截短体时，KDM2B定位于细胞质。（8）ZNF496和KDM2B都在宫颈癌组织中低表达，与患者预后不良相关，且ZNF496与核KDM2B在宫颈癌中的表达呈正相关。结论:（1）ZNF496能够抑制宫颈癌的生长和转移，且依赖RelA K37去甲基化抑制宫颈癌进展。（2）ZNF496的互作蛋白KDM2B通过其去甲基化酶活性直接下调RelA K37甲基化，负调控NF-κB活性，且依赖RelA K37去甲基化抑制宫颈癌进展。（3）ZNF496介导KDM2B和RelA的相互作用;定位于核，并通过其Linker区促进KDM2B的核定位。（4）ZNF496与其KDM2B都低表达于宫颈癌组织中;都与宫颈癌患者的不良预后相关，且ZNF496与核KDM2B的表达呈正相关。收起

关键词 : 宫颈癌发病机制 KRAB型锌指蛋白赖氨酸去甲基化酶 RelA蛋白去甲基化

9. 甲基汞在水稻中的转化、转运过程研究

[学位论文] 李院霞天津科技大学 2017年硕士导师: 张晨曦；赵甲亭共60页

摘要 : 汞是一种全球性污染物，甲基汞被认为是毒性最强的汞形态之一。水稻是我国居民甲基汞暴露的一条主要途径。本文主要研究了甲基汞和无机汞在水稻体内的吸收、富集、转运差异性以及甲基汞去甲基化现象。主要研究成果如下 (1)利用HPLC-ICP-MS结合SR... 展开汞是一种全球性污染物，甲基汞被认为是毒性最强的汞形态之一。水稻是我国居民甲基汞暴露的一条主要途径。本文主要研究了甲基汞和无机汞在水稻体内的吸收、富集、转运差异性以及甲基汞去甲基化现象。主要研究成果如下 (1)利用HPLC-ICP-MS结合SR-XANES技术分析了水稻植物甲基汞去甲基化机理。结果表明水稻根部分泌物有微弱的去甲基化现象，去甲基化率约为9％。加入叠氮化钠去甲基化减弱，说明可能是根际微生物产生的少量去甲基化。活体暴露整株植物，水稻的根和茎叶部位都有显著的去甲基化现象，去甲基化率达到50％。将根和茎叶分开剪碎分别暴露，叶子无去甲基化现象，而根部存在显著的去甲基化现象且去甲基化率可以达到90％。说明水稻植物去甲基化现象主要发生在根部而非根际微生物作用。活体暴露叶子产生的去甲基化可能是由于植物自身的交换运转。光照与黑暗条件下去甲基无显著差异，说明水稻植物不是光学去甲基化反应。 (2)利用HPLC-ICP-MS结合SR-XRF技术进一步研究了甲基汞和无机汞在水稻体内的转化转运历程。结果表明水稻根部甲基汞的富集高于无机汞，且是无机汞富集的27倍，叶子部位无机汞的吸收大于甲基汞，而水稻根部对甲基汞的吸收大于无机汞。在水稻体内甲基汞从根部向茎叶部位转运速率以及逆转运速率都高于无机汞。甲基汞从根部吸收进入木质部导管组织且主要富集在中柱部位，所以更易转运，无机汞主要分布在水稻的根部表皮层。水稻体内不存在无机汞的甲基化现象。甲基汞在水稻根部会发生去甲基化，且甲基汞在水稻体内存在内循环过程。 (3)利用HPLC-ICP-MS结合SR-XANES技术研究了不同品种水稻的去甲基化差异性以及水稻植物与其他植物的去甲基化差异性，结果表明不同品种水稻去甲基化无显著性差异，进一步说明水稻体内去甲基化是一个普遍存在现象。小麦、玉米等植物无明显去甲基化现象。收起

关键词 : 水稻甲基汞转运速率去甲基化机理

10. 去甲基化剂对胰腺癌细胞BxPC-3中microRNAs表达的影响

[学位论文] 熊海蔚南昌大学 2013年硕士导师: 李勇共58页

摘要 : 目的: 采用LNATM microRNA芯片技术，探讨去甲基化剂5-氮杂脱氧胞苷酸对胰腺癌BxPc-3细胞中microRNAs表达的影响，并获得DNA甲基化修饰的microRNA表达谱。方法: 将胰腺癌BxPc-3细胞的培养及分实验组和对照组，实验组给予5-氮杂脱氧胞... 展开

关键词 : 胰腺癌 DNA去甲基化异常表达