摘要: 冷适蛋白酶在低温下有较高的催化活性，在食品、化工、医药等领域具有潜在的应用价值，其研究已受到国内外的广泛重视。本文从中国冰川1号雪山微生物样本中筛选获得1株能够产冷适蛋白酶的耐冷菌BacilluscereusSYPA2-3，并系统开展了发酵产酶、分离纯化... 展开 冷适蛋白酶在低温下有较高的催化活性，在食品、化工、医药等领域具有潜在的应用价值，其研究已受到国内外的广泛重视。本文从中国冰川1号雪山微生物样本中筛选获得1株能够产冷适蛋白酶的耐冷菌BacilluscereusSYPA2-3，并系统开展了发酵产酶、分离纯化和酶学性质等多项研究，为深入开发我国冷适微生物资源提供了素材，并在适冷机制的理论研究方面，提出了一些有价值的观点。 SYPA2-3是一株革兰氏阳性芽孢杆菌，能在0-38℃范围内生长，最适生长温度在25℃，最大NaCl耐受浓度8％，能够利用多种碳源和氮源，VP反应、触酶实验、明胶液化实验、M-R实验呈阳性。实验测定了该株菌的16srDNA，在系统发育树中，该菌与Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis有较近的亲缘关系，结合表型分类和16srDNA序列比对结果，将SYPA2-3鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。 产酶条件研究显示，SYPA2-3最适产酶温度15℃，培养基最适初始pH6.5-7.0，可溶性淀粉、果糖和葡萄糖是较好的碳源，其适宜的浓度是10g/L，高浓度的糖能够起到代谢阻遏作用。酪蛋白是较好的氮源，其适宜浓度是10-20g/L。 实验系统地对蛋白酶的底物诱导作用和降解产物的阻遏作用进行了研究。氨基酸残基链长35-55的肽类诱导产酶能力最强，而小分子氮源能够阻遏蛋白酶的形成，因而氮源对蛋白酶合成的诱导和阻遏的双重调节功能与肽链长度有关。对粗料氮源，通过预水解可以提高培养基中α-氨基氮水平，起到促进菌体前期生长作用，能够较大幅度提高其蛋白酶产量，如预水解后的豆粕产酶增加了1100U/mL，这一机制可能应用于其它蛋白酶的生产调节。 鉴于冷适微生物最适生长温度和产酶温度的差异，实验研究了变温培养方式。在近于最适温度下进行细胞培养可缩短培养时间，获得较高的菌体浓度。采用摇瓶方式，20℃预培养16h比15℃恒温发酵产酶提高28.2％。综合应用变温培养、pH流加控制、氮源补加和产酶保护等控制策略，在5L小罐发酵产酶为4840U/mL，其产酶高峰在45h，提前了5-8h。 采用超滤和分级盐析操作能够有效去除杂蛋白，超滤浓缩实现75.3％的回收率，分级盐析酶活回收率达到56.0％。应用离子交换(DEAEfastflow)、凝胶层析(SuperdexG75)实现了BacilluscereusNeutralProtease(BcNP)的分离和纯化。严格的低温操作、快速的纯化方式和全程的酶蛋白保护措施是BcNP纯化技术的关键。 BcNP分子量为34.2kDa，pI为4.8-5.0。以酪蛋白为底物，其最适催化温度为42℃，最适pH范围为7.0-8.5。Ca2+、Mn2+对其有一定的激活作用，Cu2+、Pb2+、Co2+对活性有一定的抑制，该酶不受丝氨酸型蛋白酶抑制剂PMSF的抑制，但受EDTA强烈抑制，具有金属蛋白酶典型特性。 BcNP冷适性表现在三点：一是最适催化温度在40℃左右，低于中温酶近10℃；二是在低温下具有相对较高的催化活力；三是在0℃仍具有一定的催化能力。动力学研究表明，BcNP在低温下具有较高的催化效能，突出表现在15-35℃的范围内，Kcat/Km值变化不大，显示出较好的冷适性。热力学数据分析显示，在25-30℃温度区间的活化能最低，酶在该温度区域处于较优的催化构象。 BcNP具有热不稳定性，这是冷适酶普遍的特性。该酶在0℃下酶活半衰期为24h，在40℃处理5min，酶活损失达到80％。Ca2+和低分子量醇类物质能增强其热稳定性，其中异丙醇对酶的稳定性效果最好，如添加4％异丙醇的酶液在50℃处理20min后，仍能够保留90％以上的酶活。甲醇对BcNP除了具有稳定作用外，对酶活还有一定的激活作用，添加4％的甲醇可使酶活提高25％。酶液的光谱数据分析表明，醇类物质加入到BcNP溶液中，能够导致在250-270nm范围紫外吸收的变化，其中4％乙醇、4％异丙醇使BcNP内核氨基酸(Trp、Try、Phe)有所暴露，蛋白质构象舒张，而4％甲醇使内核包裹趋于紧密，增强了内核的刚性。但是荧光发射光谱分析认为，醇类物质加入对酶蛋白分子构象的总体影响是较小的，这种适度的作用使酶在构象上更趋于稳定。 通过酶蛋白N端测序，合成上下游引物，扩增出BcNP的基因序列，该基因编码了317个氨基酸，与B.cATCC14579中性蛋白酶基因同源度为94％。，氨基酸序列与PDB数据库中1NPC具有96.8％的相似度，具有差异的氨基酸共有10个，主要发生在芳香氨基酸之间、羟基氨基酸之间、碱性氨基酸之间以及酸性氨基酸及对应的酰胺酸之间。通过结构域序列分析，将BcNP归入MA宗族的M4家族，且系统分类为EC3.4.24.28。 利用Geno3d和Swiss-Model的Web服务器，构建出BcNP的同源模型，从热力学、立体化学和拉氏肽链结构分布等方面对模建结果进行了评价，优选出一个合理性较好的模型，通过Swiss-Model进一步优化，获得BcNP的同源模型。比较该模型与1NPC的三维结构，发现与构效关系相关的差别主要体现在：极性氨基酸减少了，降低了形成盐键的能力；氢键数目减少，造成局部肽链伸展，总体结构趋于松散；疏水性内核局部暴露，溶剂可接近性大；比表面积较大，表面电势能局部堆积。这些差别均与BcNP的热不稳定性和低温下高催化活力有密切的关系。此外，比较还发现，BcNP在二级结构上以多段结构组成的α螺旋或β折叠结构代替中温酶结构中的较长的、连续的二级结构元件，使结构上更富于柔韧性。 蛋白酶作为应用最广、产量最大的一类酶制剂，已在诸多领域创造了不可估量的经济与环境效益，但是在上述的工业体系中，还依然存在很多相对苛刻的生产环境，不利于酶技术的广泛推广和应用，其中低温催化的实现也是国内外科技工作者长期孜孜以求的目标。本文围绕着这个目标，在实践和理论上做了一些有益的探索。 收起