摘要: 背景: 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的全球患病率在逐年增加。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD的进展形式。近年来，NASH的发病机制、治疗靶标和临床药物的开发等方面取得了很多瞩... 展开 背景: 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的全球患病率在逐年增加。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD的进展形式。近年来，NASH的发病机制、治疗靶标和临床药物的开发等方面取得了很多瞩目的进展，但目前尚未批准用于该病的药物。熊果酸(Ursolic Acid,UA)是一种普遍存在于自然界的果皮树叶中的五环三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、保护线粒体功能、修复DNA损伤等重要作用，有治疗代谢综合征(Metabolic syndrome,MS)的治疗潜力，显示出治疗NASH的潜在可能。本实验旨在评估熊果酸对NASH的治疗作用及其对cGAS-STING信号通路的影响，从而为NASH提供一种确实有效的治疗药物。 第一部分熊果酸改善非酒精性脂肪性肝炎模型肝脏的脂质贮积和炎症反应 目的:观察熊果酸对NASH的治疗效果，探究其对小鼠肝脏的脂质贮积和炎性反应的影响。 方法:采用高脂高果糖饮食诱导和蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD)的方式建立小鼠的NASH模型。高脂高果糖饮食16周，第8周开始熊果酸灌胃治疗(50 mg/kg/day);MCD饮食14周，第6周开始熊果酸灌胃。给予正常饮食组，记为CTR组;给予正常饮食+熊果酸灌胃组，记为UA组;给予高脂高糖饮食组，记为HFD组;给予高脂高糖饮食+熊果酸灌胃组，记为FUA组;给予MCD饮食组，记为MCD组;给予MCD饮食+熊果酸灌胃组，记为MUA组。H&E染色和油红染色比较脂滴贮积的变化，Masson染色比较肝脏纤维化的程度，糖原染色观察肝糖原含量变化;监测体重，进行糖耐量OGTT实验和胰岛素功能ITT实验，观察胰岛素的功能和糖代谢的变化;谷丙转氨酶、谷草转氨酶的检测观察肝功能的受影响程度。同时采用逆转录-荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法分析NASH小鼠模型中肝脏的P65和NRF2的表达水平，免疫荧光观察Raw 264.7细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)生成变化情况的。最后蛋白水平检测棕榈酸(Palmitic Acid,PA)和油酸(Oleic Acid，OA)混合物作用下L02细胞的NF-κB信号通路的活化情况。 结果:1.动物模型中，熊果酸对小鼠体重的控制和糖代谢和胰岛素抵抗有一定的改善作用。病理检测发现治疗组小鼠的肝脏肝细胞间界限较NASH模型组排列整齐，轮廓清晰，胞质内的脂滴均呈现不同程度的减少和炎性反应的减轻;熊果酸改善了高脂高糖饮食诱导的肝细胞内脂肪贮积和肝细胞气球样变，并减轻了 MCD饮食诱导的小鼠肝组织的纤维化和炎症反应，抑制了肝组织中NF-κB p65的表达减少;2.细胞实验中，熊果酸抑制了高脂诱导的肝细胞中NF-κB p65、NLRP3的表达表明熊果酸发挥了抗炎作用;ROS的检测显示熊果酸改善了肝细胞的氧化应激水平，清除氧自由基，提高了肝细胞的抗氧化能力。 结论:熊果酸改善了 NASH肝脏的炎症反应和纤维化，并减轻肝细胞的脂质贮积。 第二部分熊果酸通过促进NRF2的表达并抑制的cGAS-STING信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎 目的:观察熊果酸对氧化应激相关基因NRF2的调控作用及其对cGAS-STING信号通路的影响，以探究其治疗NASH的作用机制。 方法:1.体内实验。免疫组化和蛋白免疫印迹法分析NRF2、STING及NLRP3炎症因子在熊果酸治疗后的NASH小鼠肝组织中的表达情况。2.体外实验。棕榈酸和油酸混合物作用下的细胞模型中，THP-1人巨噬细胞分别和L02人正常肝细胞、肝星状细胞(HSC)共培养，观察高脂情况下巨噬细胞对肝细胞，肝星状细胞的影响情况。STING的激动剂DMXAA干扰或shRNA敲减Raw264.7细胞内STING的表达后，检测熊果酸对Raw264.7细胞炎症因子表达的影响。使用NRF2抑制剂ML385对Raw264.7细胞进行干预后，检测熊果酸在高脂条件下对cGAS-STING/NF-κB通路分子表达的影响。JC-1检测线粒体膜电位的变化和ROS检测Raw264.7细胞氧化损伤的情况。流式细胞仪检测Raw264.7细胞的表型变化评估熊果酸对Raw264.7细胞极化的影响。免疫荧光和蛋白免疫印迹法分析NRF2、STING在棕榈酸油酸混合物处理前后Raw264.7细胞内的分布和表达情况。逆转录-荧光定量聚合酶链反应与蛋白免疫印迹法检测敲低过表达STING后Raw264.7细胞的NF-κB/NLRP3的激活情况及STING等基因的表达。 结果:1.NASH小鼠模型和棕榈酸和油酸混合物处理的细胞模型中STING的表达升高，熊果酸抑制STING的表达，从而减轻炎性细胞因子的释放，缓解脂质氧化。2.STING可促进巨噬细胞M1极化，过表达STING,M1型巨噬细胞增加，敲低STING,M1型巨噬细胞的极化减少，熊果酸可抑制巨噬细胞的M1极化。共培养体系中，巨噬细胞分泌的炎症因子可促使肝细胞的STING的表达，加重炎症反应，并促进肝星状细胞的激活，影响熊果酸的治疗效果。3.高脂诱导的脂代谢紊乱所致肝内细胞氧化应激促使NRF2的下调，接受熊果酸治疗后NRF2表达升高;而抑制NRF2的表达，STING的表达升高，熊果酸治疗效果随之下降。 结论:NASH中cGAS-STING信号通路被激活，NRF2表达受抑制，熊果酸通过促进NRF2的表达，抑制氧化应激反应和cGAS-STING信号通激活路，缓解NASH进展。 第三部分熊果酸治疗非酒精性脂肪性肝炎的差异基因和差异代谢物的筛选 目的:从转录组学和代谢组学多组学角度，探究熊果酸治疗NASH分子水平和生化水平上的变化。 方法:通过转录组测序技术，检测正常小鼠、单纯熊果酸灌胃小鼠、高脂高糖饮食喂养小鼠和高脂高糖饮食+熊果酸灌胃治疗小鼠的肝脏转录组数据。KEGG、STIRNG等数据库进行功能注释，进行GO功能和KEGG通路富集分析，结合WGCNA分析，筛选差异基因，在starBase等公共数据库中预测ceRNA网络，并在转录水平验证筛选到的差异基因。采用UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学方法，分析NASH模型小鼠肝脏代谢物的变化，筛选出NASH肝脏和熊果酸治疗后的差异性代谢物，分析熊果酸对代谢物的影响。结合主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)筛选差异代谢物，并进行差异代谢物的富集分析。 结果:1.GO功能和KEGG通路富集分析结果提示，熊果酸的治疗在分子水平的变化通路上主要集中在视黄醇代谢、PPAR信号通路、脂肪酸降解、类固醇激素生物合成、脂肪酸代谢色氨酸代谢、脂肪的消化吸收等通路，WGCNA分析筛选出关键基因AKR1A1、CHCHD2和NDUFB9,在mRNA分子水平得到验证。且根据公共数据库结合本实验的转录组数据分析预测了 ceRNA网络调控机制;2.根据代谢物的KEGG富集等数据库富集分析，差异代谢通路主要集中在视黄醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸降解、维生素的消化吸收、亚油酸代谢及胆汁分泌等，并筛选了重要的代谢物生长抑制相关的羟视黄酸、与线粒体氧化应激相关的（3S）-2-氧-3-苯基丁酸、与氨基酸与氧化脂质反应的糊精酸、甘油三丁酸酯和L-天冬酰胺-L-羟脯氨酸，这些差异代谢物可能在治疗过程中起重要作用。 结论:转录组学和代谢组学技术对熊果酸治疗NASH小鼠的肝脏代谢物进行初步研究，筛选出多种靶标基因和代谢物，尚不明确究竟何种基因和物质在治疗过程中起决定作用，这些差异基因和差异代谢物在NASH中的作用机制及其具体靶点待进一步深入研究。 第四部分肝硬化静脉曲张出血患者门静脉血栓的临床特征 目的:探讨肝硬化伴食管胃静脉曲张出血（GVB）患者门静脉血栓（PVT）的发生情况及临床特征。 方法:回顾性分析2015至2017年复旦大学附属中山医院收治的肝硬化伴GVB患者的临床资料，根据门静脉CT检查结果，将纳入的患者分为PVT组和无PVT组。比较两组实验室检查指标、肝静脉压力梯度（HVPG）和胃镜特征等。采用多因素logistic回归分析评估PVT的独立相关因素。结果 共纳入356例患者，其中117例（32.9％）有PVT。与无PVT组相比，PVT组有脾切除率、白细胞计数、血小板计数和D-二聚体水平更高，血红蛋白水平更低（P＜0.05）。PVT组重度食管静脉曲张和伴有红色征的食管静脉曲张发生率更高（P＜0.05）。多因素分析显示白细胞计数增加、D-二聚体水平升高和重度食管静脉曲张与PVT独立相关（P＜0.05）。 结论:肝硬化伴GVB患者PVT发生率较高;该类PVT患者机体炎症和促凝水平更高，伴有更严重的门静脉高压。 收起