摘要: 研究背景 地塞米松为人工合成的皮质醇激素，被广泛用于过敏性与自身免疫性疾病、严重感染及中毒的综合治疗，过量使用地塞米松可诱导骨骼肌衰减。半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)是动物凝集素家族成员，与细胞炎症、代谢及分化等关系密切，近年... 展开 研究背景 地塞米松为人工合成的皮质醇激素，被广泛用于过敏性与自身免疫性疾病、严重感染及中毒的综合治疗，过量使用地塞米松可诱导骨骼肌衰减。半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)是动物凝集素家族成员，与细胞炎症、代谢及分化等关系密切，近年来研究发现其介导了许多衰老相关疾病的恶化进程，日益受到关注。目前对半乳糖凝集素-3在骨骼肌生长发育中的作用及相关机制仍不明确。 研究目的 通过地塞米松注射建立快速的肌肉减少症小鼠模型，结合转录组学高通量测序及生物信息学分析，筛选差异表达基因并进行鉴定及验证，探讨地塞米松诱导肌肉衰减过程涉及的关键基因生物学功能;通过体内及体外实验探索半乳糖凝集素-3在地塞米松诱导的小鼠肌肉衰减模型中对骨骼肌减少的作用及其下游的调控机制;通过体外研究Gal-3在肌管生成过程中的作用，探讨其对骨骼肌成肌分化相关基因转录的可能调控机制，为肌肉减少症防治提供新思路。 研究方法 1.在体腹腔注射无菌地塞米松注射液构建小鼠肌肉衰减模型。 2.运用IlluminaNovaSeqTM高通量测序技术，检测地塞米松诱导肌肉衰减小鼠的差异表达mRNA，并采用qRT-PCR技术对差异表达mRNA进行验证。 3.结合生物信息学分析并预测地塞米松诱导肌肉衰减的效应分子。 4.应用小干扰RNA转染技术构建体外Gal-3抑制模型，用免疫荧光染色法标记肌管细胞，检测其对成熟骨骼肌纤维的调节作用。 5.在体腹腔注射Gal-3特异性抑制剂TD139构建Gal-3抑制小鼠模型，用苏木精-伊红染色和免疫组化染色方法观察小鼠骨骼肌组织形态学变化。 6.蛋白质免疫印迹技术评价不同处理对肌球蛋白表达水平的影响，并检测叉头蛋白转录因子(FoxOs)、Akt及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的蛋白磷酸化水平变化。 7.在小鼠C2C12成肌细胞中分别加入含有浓度梯度(0μM、10μM、50μM、100μM)地塞米松的完全培养基，用CCK8法检测成肌细胞增殖活性的变化，用β半乳糖苷酶染色法检测地塞米松处理后成肌细胞是否发生了衰老，用免疫荧光染色法检测成肌分化情况。 8.对小鼠C2C12成肌细胞分组进行转染阴性对照RNA片段、Gal-3小干扰RNA、加入地塞米松等处理，用CCK8法检测成肌细胞增殖活性的变化，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用蛋白质免疫印迹和qRT-PCR检测Gal-3以及成肌分化标记蛋白Pax-7、MyoD、Myogenin的蛋白和基因表达变化，用免疫荧光染色法检测成肌分化情况。 9.应用蛋白质免疫印迹和免疫共沉淀技术检测TGFβ1/Smad信号通路的变化。 10.结果采用均数±标准差(x±s)表示，采用t检验进行两组间比较，采用单因素方差分析进行多组间比较。P＜0.05代表差异有统计学意义。 研究结果 1.连续腹腔注射地塞米松10天，剂量为25mg/(kg·d·只)，可导致C57BL/6小鼠出现体重减轻、体脂沉积、肌肉纤维横截面积显著减少、肌肉萎缩相关基因表达显著增加等骨骼肌衰减症状。 2.高通量测序结果显示，地塞米松诱导肌肉衰减小鼠有101个差异表达mRNA,Lgals3为最终确定的研究对象，其编码产物为Gal-3。 3.地塞米松呈剂量依赖地上调Gal-3的基因表达，诱导骨骼肌纤维萎缩，转染小干扰RNAsi-Lgals3或使用Gal-3抑制剂TD139可显著抑制Gal-3的表达，缓解地塞米松诱导的肌萎缩。 4.地塞米松抑制Akt磷酸化，激活转录因子FoxO1、FoxO3，上调表达泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1,促进蛋白泛素化蛋白酶体途径降解，该作用可被基因沉默Gal-3或TD139逆转。 5.高剂量地塞米松导致未分化的C2C12成肌细胞增殖活性降低，细胞周期S期比例变小，成肌细胞衰老加速，分化成肌能力下降;这些结果能被基因沉默Gal-3所回复。 6.基因沉默Gal-3可抑制TGFβ1/Smad信号通路活性，促进成肌调节因子(MRFs)表达，提高成肌细胞的分化能力。 7.对地塞米松诱导肌肉衰减小鼠给予腹腔注射TD139溶液15mg/kg/天·只，可显著改善体重减轻、体脂沉积以及骨骼肌萎缩症状。 结论 1.高剂量的地塞米松可通过上调Gal-3基因表达，抑制Akt/FoxO信号通路活性，从而上调表达泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1,促进泛素蛋白酶系统的蛋白降解，诱导骨骼肌萎缩。 2.基因沉默Gal-3可通过下调成肌细胞中TGFβ1及TGFβR-Ⅰ的表达，抑制TGFβ1/Smad信号通路，从而促进MRFs基因表达，缓解地塞米松造成的负性成肌作用，促进成肌分化。 收起