摘要: 目的:在畜牧养殖业中，应激是最常见的导致动物健康及生产性能下降的不利因素。应激时，动物体内的应激激素-糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)水平会显著升高，适度时发挥生理作用，而过度时则产生病理作用。在动物正常生长发育过程中，特别是怀孕期间，... 展开 目的:在畜牧养殖业中，应激是最常见的导致动物健康及生产性能下降的不利因素。应激时，动物体内的应激激素-糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)水平会显著升高，适度时发挥生理作用，而过度时则产生病理作用。在动物正常生长发育过程中，特别是怀孕期间，易受外界刺激而导致应激，此时体内GC水平升高以增强机体对应激刺激的抵抗力，但过量分泌时会影响机体发育。临床上常用GC治疗多种疾病，但使用过量时会导致严重的不良反应和副作用。例如，应用大量外源性合成GC-地塞米松(Dexamethasone,Dex),会诱导肌肉萎缩。GC诱导肌肉萎缩的可能原因有多种，一般认为其通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)结合影响了蛋白质的降解、合成。体外研究显示，低剂量的GC对成肌分化和肌管融合有促进作用，高剂量的GC则可诱导成肌细胞死亡或肌管变窄，可见GC对成肌细胞的分化有复杂的双向作用。目前，关于GC影响动物肌肉发育的研究大都集中在小鼠和人上，而且具体调控机制尚未阐明。绵羊是一种主要的肉用家畜，我们前期研究表明，其肌肉发育易受GC的影响，但有关GC对成肌分化过程动态调控的系统机制尚不清楚。因此，本研究旨在利用Dex处理绵羊胎儿成肌细胞(Sheep fetal myoblast,SFMs)并诱导其分化来模拟体内应激状态，基于转录组高通量测序并结合其它分子细胞生物学方法，系统研究Dex影响SFMs分化的动态调控机制。 方法:使用两步酶消化法分离原代SFMs,利用差速贴壁法纯化并使用免疫荧光染色技术对其进行鉴定;使用2％的马血清进行诱导分化，采用qRT-PCR和Western blot技术检测SFMs分化过程中成肌特异性基因在mRNA和蛋白水平的表达变化，并通过皮尔森相关系数法分析其相关性。然后使用不同浓度的Dex处理SFMs,并诱导分化，采用MTT和ROS检测及流式细胞检测筛选合适的作用浓度及时间。通过肌管直径和融合指数分析及透射电镜观察，判断Dex处理致SFMs应激模型是否建造成功。造模完成后,通过RNA-seq技术检测分析正常与Dex处理致应激条件下SFMs分化过程中的转录组学变化，并筛选Dex影响SFMs分化的关键差异基因和信号通路。最后采用qRT-PCR和Western blot技术，对挑选的表达量较高且差异显著的代表性基因和关键通路蛋白进行检测，同时联合使用GR拮抗剂RU486,以探究Dex影响SFMs分化的可能途径并验证相关机制是否由GR介导。 结果: 1.SFMs分化过程中特异性基因的表达模式及相关性分析 结果显示，分离纯化的SFMs在诱导分化后可以形成肌管，成肌标记因子MyoD、MyoG、myomaker、desmin 和 MyHC 在 SFMs 中呈阳性表达。MyoD、MyoG 和 myomaker基因的mRNA表达在SFMs分化过程中呈先上升后下降趋势，Myf5、PAX3和PAX7基因的mRNA表达在SFMs分化过程中呈下降趋势，Myf6、desmin,MYH1、MYH2、MYH4和MYH7基因的mRNA表达在分化过程中呈上升趋势，而MSTN基因的mRNA表达在分化过程中呈上下波动状态。除MSTN外，其它基因在SFMs分化过程中的蛋白表达与其mRNA表达趋势基本一致。部分基因在mRNA和蛋白水平的表达存在显著或极显著相关性。一些转录因子蛋白(MyoD、Myf5、Myf6、PAX3和PAX7)与其自身或其它部分基因的mRNA之间也存在显著或极显著相关性。 2.Dex处理致SFMs应激模型的建立 MTT检测结果显示,Dex浓度在0.0234375 mg/mL～0.375 mg/mL范围内可使SFMs造成不同程度病变。流式细胞检测和ROS荧光强度分析结果显示，0.375 mg/mL的Dex处理组SFMs产生的ROS水平最高。肌管直径和融合指数分析结果显示，0.375 mg/mL的Dex处理组细胞形成的肌管直径较小、融合指数较低。透射电镜观察结果显示，0.375 mg/mL的Dex处理组细胞其胞核结构不完整，线粒体肿胀或皱缩、线粒体嵴消失，并有大量自噬小体和自噬溶酶体产生。 3.正常与应激条件下SFMs分化过程中的转录组学变化 结果显示，在正常分化过程中，分化24h、48h和72h组与分化0h组相比分别有2362、5656和4611个DEGs,3个比较组的共性DEGs为1541个。在应激条件下，分化24h、48 h和72 h的处理组与未处理组相比分别有3566、2410和3314个DEGs,3个比较组的共性DEGs为1080个。既与分化相关又与应激相关的共性DEGs为320个,其中具有明显表达变化规律(即分化后表达上升或下降，加Dex处理后表达变化被逆转)的关键DEGs为153个，这些共性DEGs在ECM受体相互作用信号通路(ECM-receptor interaction)、黏着斑信号通路(Focal adhesion)、PI3K-Akt信号通路和细胞周期信号通路(Cell cycle)中显著富集。 4.Dex 通过 GR 介导的 ECM-Integrin-FAK-Akt-CDK 通路影响 SFMs 分化 qRT-PCR检测结果显示，与正常分化72 h相比，代表性关键基因FBLN5、ITGA4、MEF2C和MYH7的表达在Dex处理的分化组显著下降，而GPX4和FABP4的表达显著上升，联合使用RU486后这些基因的表达变化被明显逆转;Western blot检测结果显示,加入Dex处理后相关蛋白FBLN5、ITGA4、p-FAK、p-Akt和Rb的表达显著下降，而CDK4、CCND3和p-Rb蛋白的表达显著上升，联合使用RU486后这些蛋白的表达变化被逆转。 结论:(1)用两步酶消化法可以方便快速地分离获得具有良好分化能力的SFMs,成肌特异性基因在SFMs分化过程中具有相似或不同的表达模式，且部分基因之间存在显著或极显著相关性。(2)用0.375 mg/mL的Dex处理SFMs可成功建立应激模型，且该浓度作用下的SFMs分化被抑制。(3)转录组测序筛选到320个与分化、应激均相关的共性DEGs,其中在ECM受体相互作用、黏着斑、PI3K-Akt信号通路和细胞周期信号通路中显著富集的共性DEGs为Dex影响SFMs分化的关键DEGs。(4)Dex可通过GR介导的部分差异基因表达及ECM-Integrin-FAK-Akt-CDK通路影响SFMs分化。 本研究结果将为阐明应激通过GC影响绵羊成肌分化的分子网络调控机制奠定重要基础，同时也可为动物肌肉相关疾病的预防和治疗提供理论依据。 收起