摘要: 背景与目的 骨组织工程(BoneTissueEngineering,BTE)是伴随生物技术、材料科学及再生医学进步而快速发展的交叉学科，具有供体来源不受限、修复效果理想等优点，是当前骨缺损治疗的研究热点。支架材料的性能对于BTE技术极为关键，故如何制备可有效... 展开 背景与目的 骨组织工程(BoneTissueEngineering,BTE)是伴随生物技术、材料科学及再生医学进步而快速发展的交叉学科，具有供体来源不受限、修复效果理想等优点，是当前骨缺损治疗的研究热点。支架材料的性能对于BTE技术极为关键，故如何制备可有效负载并缓释生长因子、生物相容性良好、降解性优良的支架材料，构建具有高效骨传导性和骨诱导性的细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)微环境，是本实验研究的目的和重点。 静电纺丝制备的纳米纤维支架具有三维多孔交联结构，可有效模拟ECM微环境，并实现药物的有效负载。另外一种载药方式是直径10-1000nm的蛋白纳米颗粒，其具有良好的生物相容性、可降解性、药物输送性能和骨诱导性能。在BTE载药支架的设计中，如果将载药纳米颗粒嵌入静电纺丝纤维支架中，则可改进静电纺丝的载药性能，药物的释放分别经历了静电纺丝纤维的降解和纳米颗粒的降解两个阶段，既保证了药物的生物活性，又实现了药物的持续缓慢释放。 阿司匹林又名乙酰水杨酸(Acetylsalicylicacid,ASA)，是一种广泛使用的镇痛、解热和抗炎药物，可以促进骨髓间充质干细胞和人牙髓干细胞的成骨分化，增加骨密度和改善骨形成。阿巴洛肽(Abaloparatide)于2017年获美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准上市，是目前最新的治疗骨质疏松症的临床用药，通过选择性激活甲状旁腺激素Ⅰ型受体的信号通路，促进间充质干细胞向成骨细胞分化。与上代药物特立帕肽(Teriparatide)相比，Abaloparatide可更有效促进骨矿物质密度的增加，并减少高钙血症的发生。在BTE支架材料设计中，可将ASA和Abaloparatide联合应用，以期发挥Abaloparatide和ASA协同促骨生成的作用，构建良好的促成骨免疫微环境。 在支架设计中将多种材料的优势相结合，可形成性能优异的BTE复合支架。聚己内酯(Poly(ε-caprolactone)，PCL)可以通过静电纺丝技术制成纳米纤维支架，为细胞提供粘附、增殖和分化的场所。纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HA)是入骨的主要无机成分，已被广泛用作骨移植的生物陶瓷材料。壳聚糖(Chitosan)可以增强细胞粘附、增殖，促进成骨细胞(Osteoblast,OB)的分化和矿化。 基于以上认识，本研究旨在设计一种可序贯控释阿司匹林和阿巴洛肽的纳米颗粒/静电纺丝复合支架。首先通过去溶剂法构建负载Abaloparatide的牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)纳米颗粒，然后在BSA纳米颗粒外层制备出Chitosan稳定层。随后将载Abaloparatide纳米微颗粒与ASA和n-HA复合负载到PCL静电纺丝纤维支架中，制备出一种新型的纳米颗粒/静电纺丝复合支架。 ASA处于静电纺丝载体中，Abaloparatide处于纳米颗粒和静电纺丝的双重载体中，药物在不同的载体中释放，ASA释放较早较快，Abaloparatide释放相对缓慢和持续，实现了ASA和Abaloparatide的序贯控释，以期在骨形成早期发挥ASA的抗炎作用而构建良好的促成骨免疫微环境，在骨形成过程中发挥Abaloparatide和ASA协同促骨生成的作用，为骨再生提供高效的ECM微环境。该复合支架将多种生物相容性及降解性良好的材料复合使用，更加符合组织工程支架的需求。通过理化性质测试、体外实验和体内实验探究该复合支架材料的促骨再生能力，为BTE支架材料的设计提供新的药物递送方式选择，为BTE用于骨缺损的临床治疗提供有价值的思路和方法。 材料与方法 1.序贯控释阿司匹林和阿巴洛肽的纳米颗粒/静电纺丝复合支架的构建 利用去溶剂法制备载Abaloparatide的BSA纳米颗粒，通过静电自组装原理在纳米颗粒表面吸附一层Chitosan,形成Chitosan保护层。将载Abaloparatide的纳米颗粒(Chi/ANPs)、ASA、n-HA一同载入PCL基质中进行静电纺丝，制备出负载阿司匹林和阿巴洛肽的纳米颗粒/静电纺丝复合支架。纤维支架分为5组，即空白支架(PCL/HA),载ASA支架(ASA/PCL/HA)，不载药纳米颗粒支架(NPs/PCL/HA)，载Abaloparatide纳米颗粒支架(ANPs/PCL/HA)，同时负载ASA和载Abaloparatide纳米颗粒的复合支架(ANPs/ASA/PCL/HA)。通过理化性质测试研究纳米颗粒和纤维支架的形态和结构、表面表征、机械性能、体外降解性、药物释放等特性。 2.纳米颗粒/静电纺丝复合支架的体外成骨诱导活性研究 将各组支架材料与MC3T3-E1细胞进行共培养。支架材料的骨传导性能通过细胞粘附的扫描电镜(Scanningelectronmicroscopy,SEM)观察、细胞黏附率测定、荧光染色、活细胞/死细胞染色、细胞活性检测(Cellcountingkit-8,CCK-8)实验进行研究。支架材料的骨诱导性能通过细胞的茜素红染色(AlizarinRedS，ARS)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)染色、ALP测定、逆转录PCR(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Westernblot)方法研究。 3.纳米颗粒/静电纺丝复合支架的体内骨缺损修复能力研究 建立大鼠支架材料皮下植入模型，通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosinstaining，HE)染色、Masson染色、免疫组化染色方法检测复合支架的体内局部宿主反应，研究其生物安全性。建立大鼠颅骨缺损修复模型，通过Micro-CT(Micro-computedtomography)、HE染色、Masson染色、免疫组化染色方法探讨复合支架修复大鼠颅骨缺损的能力。 结果 1.成功制备具有壳聚糖稳定层的载阿巴洛肽纳米颗粒 实验制备了具有Chitosan稳定层的BSA纳米颗粒，载Abaloparatide纳米颗粒为Chi/ANPs,不载药纳米颗粒为Chi/NPs。透射电镜(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)可见纳米颗粒呈形态规整的圆形，表面光滑，颗粒分散度较好。动态光散射(Dynamiclightscattering,DLS)分析显示Chi/NPs的平均直径为330±39nm,Chi/ANPs的平均直径为289±34nm。Zeta电位结果显示当BSA溶液的pH为8.5时，制备的纳米球具有最佳稳定性，在此PH值下，Chi/NPs和Chi/ANPs的Zeta电位达最大值。衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(Attenuatedtotalreflection-fouriertransforminfraredspectroscopy,ATR-FTIR)分析证实纳米颗粒表面包覆有Chitosan,且BSA和Chitosan没有发生物质改变。Abaloparatide在纳米颗粒中的包封率为85.602±3.927％。 2.成功制备载阿司匹林和阿巴洛肽的纳米颗粒/静电纺丝复合支架 将Chi/ANPs纳米颗粒载入含ASA、n-HA的PCL基质中，制备出纳米颗粒/静电纺丝复合支架。SEM可见5组纤维支架均由纳米级丝状结构相互重叠交织，呈现立体网状结构，形成不规则孔隙，孔隙相互交通。含纳米颗粒的纤维支架表面略粗糙，可见小结节样凸起。TEM图像证实纳米颗粒被包裹并分散在纤维基质中，纤维基质中可见散在分布的n-HA颗粒。ATR-FTIR结果证实制备静电纺丝的过程中，纳米颗粒结构稳定。亲水性及拉伸强度实验提示ASA及纳米颗粒的负载对纤维支架的亲水性有促进作用但会导致拉伸强度下降。体外降解实验显示n-HA、ASA及纳米颗粒的载入可调节材料降解时间，n-HA的载入可对抗材料降解造成的溶液酸化问题。 3.纳米颗粒/静电纺丝复合支架可实现阿司匹林和阿巴洛肽的序贯释放 ANPs/ASA/PCL/HA组中ASA和Abaloparatide实现了序贯释放。ASA的释放经过两个阶段:初始快速释放及后期持续释放，大部分ASA在前8d释放，之后释放量增加较小。Abaloparatide由于纳米颗粒和静电纺丝纤维的双重保护作用，表现为类似于零级释放的缓慢释放模式，在前几天略有释放，但释放量处于较低水平，然后表现出稍加速但恒定的释放，缓释时间长达30d以上。单药物支架ASA/PCL/HA和ANPs/PCL/HA的药物释放曲线与双药物支架ANPs/ASA/PCL/HA相似，但释放速率较低，这与ANPs/ASA/PCL/HA支架优异的亲水性和降解性有关。 4.纳米颗粒/静电纺丝复合支架具有良好的生物相容性 细胞粘附的SEM结果显示MC3T3-E1细胞良好附着并伸展于支架表面，伸出伪足，彼此相连。荧光染色结果显示细胞在支架的不同层面可见，呈现立体分布状态，嵌入纤维支架内部细胞形态和铺展情况良好。活细胞/死细胞荧光染色证实各组纤维支架均具有良好的生物相容性。 5.纳米颗粒/静电纺丝复合支架具有良好的体外骨传导和骨诱导性能 CCK-8实验结果显示5组支架材料的细胞增殖情况均优于阴性对照组，ANPs/ASA/PCL/HA组细胞增殖效果最好，第3d开始超过其他材料组，第5d开始超过阳性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。早期ASA的突释后对细胞的增殖产生了短暂的不利影响，后期适宜浓度的ASA可促进细胞增殖，ASA和Abaloparatide的序贯释放可以促进细胞的增殖。ALP染色显示各组支架上的MC3T3-E1细胞均经历了成骨分化，NPs/PCL/HA和PCL/HA组的趋势相似,ANPs/ASA/PCL/HA组从第14d开始ALP活性一直处于最佳状态。ARS结果与ALP结果类似，5组纤维支架上的红色钙化结节均多于对照组，其中ANPs/ASA/PCL/HA组红色结节数量及面积最大。成骨相关基因及成骨相关蛋白表达检测结果显示，单药物支架ASA/PCL/HA和ANPs/PCL/HA均能高表达Runt相关转录因子2(Run-relatedtranscriptionfactor2,Runx2)，成骨细胞特异性转录因子(Osterix)，骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和骨钙素(Osteocalcin,OCN)的基因和蛋白，与阳性对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，而双重负载ASA和Abaloparatide的ANPs/ASA/PCL/HA组表达Runx2、Osterix、OPN、OCN的基因和蛋白量均最高，表明ANPs/ASA/PCL/HA复合支架可通过Runx2，Osterix,OPN及OCN途径促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，ASA和Abaloparatide在促成骨分化方面具有协同促进作用。 6.纳米颗粒/静电纺丝复合支架具有良好的生物安全性和体内骨缺损修复性能 (1)体内皮下材料植入实验 在大鼠体内皮下植入支架材料，观察局部宿主反应，结果显示2w各组支架有少量炎症细胞浸润，以巨噬细胞为主，主要分布于纤维支架与组织包膜交界处。载ASA的复合支架ASA/PCL/HA、ANPs/ASA/PCL/HA的炎症细胞浸润程度较低，ASA的抗炎作用可以抑制炎性因子的表达，ASA的早期缓释大大控制了材料的早期炎症细胞浸润。 (2)大鼠颅骨缺损修复实验 Micro-CT结果显示空白对照组无法完成骨缺损的修复，5组支架材料植入后修复效果均优于对照组，修复效果的规律是载药组＞单纯支架组＞对照组，其中载双药ANPs/ASA/PCL 收起