摘要: 在水产养殖中低氧是限制鱼类生长、发育、存活的关键影响因素，可以严重阻滞早期器官的发育。microRNAs（miRNAs）作为一类重要的转录后调节因子，广泛参与机体的各项生命活动，如组织器官的发育，营养物质的代谢以及对各类环境因子的应激等。本实验室... 展开 在水产养殖中低氧是限制鱼类生长、发育、存活的关键影响因素，可以严重阻滞早期器官的发育。microRNAs（miRNAs）作为一类重要的转录后调节因子，广泛参与机体的各项生命活动，如组织器官的发育，营养物质的代谢以及对各类环境因子的应激等。本实验室前期研究发现miR-462-731簇参与低氧调控，并且miR-462和miR-731在受精后3-5天（dayspostfertilization,dpf）在斑马鱼肝脏和消化道区域均特异表达，Morpholino（MO）敲降后心包腔膨大及心肌收缩信号通路上调，这些结果说明miR-462-731簇可能参与肝脏和心脏等器官的发育。为了进一步研究该基因簇在鱼类器官早期发育中的作用及调节机制，本研究以斑马鱼为研究对象，基于敲降、过表达、敲除及RNA-Seq等技术，对miR-462-731簇在肝脏及心脏等器官发育中的功能进行了深入研究。本研究主要结果如下： 1.基于整胚原位杂交（Whole-mountinsituhybridization,WISH）检测肝脏等消化器官的标记基因fabp10a、fabp2、try和ins发现，在96hpfmiR-462/miR-731敲降会导致斑马鱼胚胎肝脏和外分泌胰腺发育严重受损，伴随着一系列肝脏和外分泌胰腺相关基因表达异常，并且这种缺陷可以被相应的miRNA模拟物部分挽救。另外我们也发现miR-462敲降可以特异地导致外分泌胰腺分为两团，并且这种表型在胰腺发育早期阶段就已存在，表明miR-462可能特异地调控外分泌胰腺早期的形态发生。对内胚层标记基因foxa3和肝脏前体细胞标记基因prox1的检测证实，抑制miR-462/miR-731的表达不影响斑马鱼肝脏前体细胞的特化和肝脏原基的形成。基于fabp10a、cp、prox1的检测结果进一步发现，miR-462/miR-731敲降体的肝脏在60hpf到96hpf期间存在明显的生长停滞，并且这种发育缺陷很可能是肝脏分化异常导致的。靶基因预测和双荧光素酶验证发现Wnt/β-catenin通路成员dkk3b（dickkopfWntsignalingpathwayinhibitor3b）为miR-731直接下游靶基因，同时定量PCR检测结果显示miR-731负向调控经典Wnt/β-catenin信号通路。在斑马鱼胚胎中过表达dkk3b可以模拟miR-731敲降导致的肝脏和外分泌胰腺变小的缺陷，然而用β-catenin抑制剂XAV939处理并不能挽救肝脏和外分泌胰腺变小的表型，表明miR-731可以通过直接靶向dkk3b而不是Wnt/β-catenin通路来调控肝脏和外分泌胰腺的发育。 2.本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了miR-462和miR-731同时缺失的突变体miR-462-731-/-和miR-731特异缺失的突变体miR-731-/-。由于没有筛选到有效敲除miR-462的靶点，因此我们重点研究了miR-731在斑马鱼胚胎中的功能。结果发现miR-731-/-突变体胚胎低氧耐受能力下降，此外miR-731MO敲降体和miR-731-/-斑马鱼胚胎在早期表现出明显的心脏功能障碍，具体表现为心包腔膨大、心率降低以及有时泵血不连续。WISH检测证实miR-731MO敲降体和miR-731-/-胚胎心脏发育存在环化异常、心室膨大以及心肌肥大。基于双荧光素酶和Westernblot检测，证实Calcineurin的重要底物活化T细胞核因子NFATs家族的nfatc3a是miR-731的直接下游靶基因。miR-731-/-突变体中非磷酸化Nfatc3a蛋白明显增多，calcineurin异常上调同时serca2异常下调，表明Calcineurin/Nfatc3a通路在miR-731-/-突变体中被激活。进一步检测发现，Calcineurin抑制剂FK506处理可以有效地挽救miR-731缺失导致的心脏功能和发育缺陷，并在一定程度上缓解了心肌肥大。该结果证实Calcineurin/Nfatc3a信号通路参与miR-731缺失介导的心脏发育缺陷以及心肌肥大，同时表明miR-731作为心肌肥大的负调节因子，可以间接拮抗Calcineurin和直接拮抗Nfatc3a在抑制病理性心肌肥大中发挥了重要功能。 3.基于WISH及转录组测序发现miR-462-731-/-突变体中，肝脏和外分泌胰腺的发育不仅没有表现出比miR-462和miR-731敲降更严重的变小，反而没有受到影响甚至有变大的趋势，与此同时，心脏的发育和功能也没有受到影响，因此推测miR-462-731-/-在miR-462和miR-731同时缺失的情况下，触发了一种强有力的补偿机制，这种机制几乎完全补偿了miR-462和miR-731在肝脏、外分泌胰腺以及心脏中的功能。miR-731-/-表现出一定程度的肝脏和外分泌胰腺变小，同时伴随着一系列肝脏和外分泌胰腺相关基因表达下调，但是该敲除体肝脏和外分泌胰腺发育缺陷程度远远小于miR-731MO敲降体，同样在miR-731缺失导致的心肌肥大中，miR-731-/-要比miR-731敲降体的表型轻很多，这种现象是否是因为同为一簇的miR-462的存在在一定程度上补偿了miR-731的功能以及miR-462敲降特异导致外分泌胰腺形态发生异常的机制等都需要进一步深入研究。 收起