摘要: 研究背景 Wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白，分子量约为40kDa,参与多种生物学现象的细胞因子，可激活经典/非经典Wnt信号通路。非经典Wnt信号通路中对骨组织产生的作用十分深远，它能与多条重要的人体信号通路相互交联，共同调控骨的生成、平衡和吸收。... 展开 研究背景 Wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白，分子量约为40kDa,参与多种生物学现象的细胞因子，可激活经典/非经典Wnt信号通路。非经典Wnt信号通路中对骨组织产生的作用十分深远，它能与多条重要的人体信号通路相互交联，共同调控骨的生成、平衡和吸收。如:环磷腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和Hippo通路等。然而作为Wnt蛋白家族的一员，Wnt2b蛋白一直以来发挥着上皮间充质转化、个体发育、肿瘤的增殖和迁移侵袭等重要作用，关于其在成骨方面的具体通路尚未报道。课题组前期研究中发现，Wnt2b可以调控人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化，但是关于Wnt2b如何调节hBMSCs具体机制通路尚不清楚。因此，本课题进一步探讨Wnt2b调控hBMSCs成骨分化作用及机制通路。 方法 通过高通量测序hBMSCs成骨分化后mRNA差异表达谱进行分析，结果显示Wnt2b及相关成骨标记基因RUNX2、BMP4和Sp7表达水平显著上调，并通过功能获得实验、qRT-PCR和WesternBlot验证Wnt2b与成骨分化之间的关系。随后对高通量测序得到的差异基因进行GO和KEGG富集分析，并通过功能缺失实验、免疫荧光和染色实验，确定Hippo-YAP/TAZ通路和FZD5受体参与其中。最终通过功能缺失实验，以确定Wnt2b促进hBMSCs成骨分化的具体调控网络。 结果 将成骨诱导分化前后的hBMSCs进行高通量测序分析，发现成骨诱导后Wnt2b和成骨相关标记基因RUNX2、BMP4和Sp7均表达上调，并通过功能获得实验证明Wnt2b与RUNX2、BMP4、Sp7之间存在正相关关系。将差异基因进行GO和KEGG富集分析，筛选相关分子功能和信号通路，发现差异基因主要富集的与成骨分化相关的有Hippo-YAP/TAZ通路。WesternBlot和qRT-PCR结果确认Hippo-YAP/TAZ通路参与其中。为了进一步确定Wnt2b与Hippo通路之间的串联关系，通过构建si-YAP/TAZ细胞，进行功能缺失实验，发现Wnt2b和YAP/TAZ之间存在正相关关系，并影响成骨标记基因的表达。为确定细胞表面受体，通过功能缺失实验，确定了Wnt2b配体通过FZD5受体激活YAP/TAZ的非经典Wnt信号通路。进一步通过功能缺失实验，确定该通路上下游具体信号因子，发现Wnt2b-FZD5-Gαq/11-Rho-Lats1通路激活YAP/TAZ。最后为确定YAP/TAZ入核后结合的转录因子，通过功能缺失实验，确定TEAD1为该通路的转录因子，调控RUNX2、BMP4、CTGF等成骨标记基因的表达。 结论 综上所述，本研究确定了Wnt2b-FZD5-Gαq/11-Rho-Lats1-YAP/TAZ-TEAD1的信号通路，具体通路机制为:Wnt2b通过FZD5受体，激活Gαq/11,Gαq/11激活Rho,Rho抑制Lats1功能，进而抑制Lats1对YAP/TAZ的磷酸化，使更多的YAP/TAZ入核与TEAD1结合，转录成骨相关基因（RUNX2、BMP4和CTGF）,最终促进hBMSCs成骨分化。本课题拓宽非经典Wnt信号通路调控网络，更为hBMSCs应用于骨组织工程，修复骨缺损提供新的理论基础。 收起