摘要: [目的]桃属于典型的呼吸跃变型果实，采后桃果实常温下易软化，快速后熟和衰老，缩短贮藏期。低温贮藏有利于桃果实采后保鲜，但是桃果实对低温敏感，连续低温容易造成冷害，产生大量的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)引起氧化损伤造成线粒体功能障... 展开 [目的]桃属于典型的呼吸跃变型果实，采后桃果实常温下易软化，快速后熟和衰老，缩短贮藏期。低温贮藏有利于桃果实采后保鲜，但是桃果实对低温敏感，连续低温容易造成冷害，产生大量的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)引起氧化损伤造成线粒体功能障碍。因此，探索维持线粒体功能的完整性和缓解线粒体的氧化损伤机制，对于保持果实贮藏品质，延缓果实衰老具有重要意义。研究表明一氧化氮(nitricoxide,NO)是参与植物对生物和非生物胁迫反应的重要信号分子，对植物成熟衰老以及缓解贮藏冷害具有调控作用。目前关于NO对采后冷藏果实线粒体的氧化损伤的研究主要集中在对冷藏果实线粒体中抗氧化酶系统的调节作用，对植物线粒体功能以及线粒体基因的复制和转录是否具有调控作用研究较少，同时DNA甲基化是植物应对非生物胁迫的一种显著的基因修饰，本研究探讨了桃果实在冷藏过程中NO对线粒体功能和线粒体基因复制和转录的影响，以及NO与DNA甲基化之间的关系，为缓解低温氧化损伤对桃果实贮藏品质的影响，缓解桃果实贮藏冷害、提高冷藏桃果实耐冷性，提供理论依据。 [方法]以‘肥城’桃果实为试验试材，使用NO溶液(15μmolL-1)、c-PTIO(20μmolL-1,carboxy-PTIO,NO清除剂)溶液，清水(对照)浸泡桃果实30min,处理结束后0℃中贮藏5周，测定冷藏桃果实的品质、线粒体功能和抗氧化系统相关指标，研究外源NO处理对冷藏桃果实线粒体功能和线粒体氧化损伤的调控作用。采用RT-PCR技术克隆了桃果实线粒体转录终止因子18(Mitochondrialtranscriptionterminationfactors,mTERF18)基因，利用农杆菌介导的瞬时转化，在番茄和桃果实中过表达PpmTERF18基因，探讨了PpmTERF18在果实线粒体功能和抗氧化生理中的作用。利用亚硫酸氢盐测序PCR(BisulfitesequencingPCR,BSP)技术，探讨了NO对冷藏桃果实DNA甲基化的调控作用。 [结果](1)外源NO处理显著提高了内源NO含量，抑制了冷藏桃果实贮藏品质的下降，延缓采后桃果实的褐变及软化;同时显著抑制冷藏桃果实线粒体ROS含量的增加，提高了ROS代谢相关酶的活性，缓解了冷胁迫对桃果实造成的氧化应激;并显著抑制了线粒体膜流动性和线粒体呼吸控制速率的下降，抑制了线粒体通透性转换孔(Mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP)的开放和线粒体耗氧量的上升，维持线粒体功能;但是显著上调桃果实中PpmTERF18的表达量和增加线粒体DNA拷贝数，表明NO可以通过调控线粒体拷贝数来维持线粒体DNA(MitochondrialDNA,mtDNA)的稳定性。 (2)桃果实mTERF18蛋白由573个氨基酸残基构成，分子量为64996.38,是不具有分泌信号肽的亲水性蛋白质。蛋白质的二级结构预测发现桃果实mTERF18蛋白中α-螺旋和不规则螺旋是整个蛋白质结构中的主要结构元素。桃果实mTERF18基因序列保守，与杏仁、甜樱桃、白梨、苹果、月季等的序列具有高度相似性。烟草亚细胞定位结果显示其定位于线粒体中。Gaussian软件模拟结果显示，NO与桃果实mTERF18在谷胱甘肽化反应中，Cys281有最好的反应活性和稳定性;NO与桃果实mTERF18在亚硝基化反应中，Tyr300有最好的反应活性和稳定性。 (3)在番茄中过表达PpmTERF18延缓番茄果实的转色;在桃果实中过表达PpmTERF18可以保持桃果实的外观形态。过表达PpmTERE18显著增加了番茄和桃果实线粒体ROS代谢相关酶的活性和基因的表达量;同时显著提高了抗氧化系统的防御能力，降低了番茄和桃果实中线粒体O2·-、H2O2、·OH的含量，减少了ROS产生，减轻了番茄和桃果实的氧化损伤;但是显著抑制了番茄和桃果实线粒体膜电位、膜流动性和线粒体呼吸控制率的降低，抑制了MPTP的开放，降低线粒体耗氧量和细胞色素c含量，增加线粒体DNA拷贝数，减少mtDNA损伤，从而维持了线粒体的功能。另外过表达PpmTERF18显著提高了桃果实中总酚和总黄酮的含量，降低了丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量，保持了膜稳定性，提高了苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase,PAL)的活性，表明过表达PpmTERF18可以增强果实的抗逆性，维持果实贮藏品质。 (4)外源NO显著上调了DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)活性，以及甲基化酶和去甲基化酶相关基因表达量;NO处理显著上调了冷藏桃中PpCBF5、PpICE1、PpMYC2、PpCOR的表达量，对四个转录因子(Transcriptionfactor,TF)的CpG岛和启动子区域的进一步BSP分析表明，NO信号诱导PpCBF5、PpICE1和PpMYC2启动子的甲基化增加以及PpCOR启动子区域的去甲基化。启动子区域中的不同CpG岛对NO调节具有不同的响应，并且NO可以修饰胞嘧啶C甲基化位点。NO通过调控耐冷转录因子的表达量和甲基化水平，参与冷应激过程，表明NO、冷胁迫和DNA甲基化密切相关，解释了NO通过介导DNA甲基化增强桃果实的耐冷性。 [结论]外源NO显著提高冷藏桃果实线粒体内活性氧的清除能力，维持细胞膜的完整性和功能，降低了桃果实低温贮藏期间的氧化损伤;桃果实mTERF18蛋白定位于线粒体中，由573个氨基酸组成,不具有分泌信号肽和跨膜结构的不稳定的亲水性蛋白质。在谷胱甘肽化反应中，mTERF18氨基酸序列的Cys281与NO反应有好的反应活性和稳定性;过表达PpmTERF18显著提高番茄和桃果实线粒体抗氧化系统的防御能力，维持线粒体的功能;NO调控桃果实中耐冷转录因子转录水平的增加，增强了桃果实的耐冷性。揭示了外源NO通过提高冷藏桃果实线粒体的抗氧化系统的防御能力和介导DNA甲基化增强桃果实的耐冷性，提高冷藏桃果实的贮藏品质，缓解桃果实贮藏冷害。 收起