摘要: 乳腺是哺乳动物位于乳房内的外分泌腺体，可以分泌乳汁来哺育后代。随着生殖周期的发生，乳腺细胞会经历重复的增殖扩张、分泌功能分化和退化等生理过程。特别是在非泌乳期，乳腺细胞会经历凋亡和自噬等退化过程，然后再恢复至妊娠期之前的状态，从而... 展开 乳腺是哺乳动物位于乳房内的外分泌腺体，可以分泌乳汁来哺育后代。随着生殖周期的发生，乳腺细胞会经历重复的增殖扩张、分泌功能分化和退化等生理过程。特别是在非泌乳期，乳腺细胞会经历凋亡和自噬等退化过程，然后再恢复至妊娠期之前的状态，从而为新一轮泌乳活动做准备，这表明乳腺细胞具有高度可塑性。当前在啮齿动物和奶牛身上开展的乳腺退化和重塑的研究为乳腺发育与泌乳生物学提供了基础和借鉴，然而奶山羊作为具有重要经济价值的乳用家畜，乳腺退化和重塑过程至今尚未明确。因此，本研究以泌乳末期（产后240天）、干奶期（产后300天）和妊娠后期（配种后140天）的崂山奶山羊乳腺组织为研究对象（每个时期为3个样本），开展了非泌乳期乳腺组织的全转录组学测序，以期揭示非泌乳期乳腺组织的转录组特征，从编码RNA（mRNA）和非编码RNA（miRNA、lncRNA和circRNA）多角度去阐明山羊乳腺细胞退化和重塑的分子调控机制。研究结果主要分为以下四个方面: 1.mRNA组学分析结果显示，本研究成功构建9个山羊乳腺组织转录组文库，每个文库平均获得1.53亿个干净读数，且与山羊参考基因组的比对率≥95％。在3个不同发育阶段（LL、DP和LG）的乳腺组织中共鉴定1,381个差异表达基因。功能富集分析结果表明，差异基因主要富集到与细胞生长、凋亡、免疫，以及营养物质转运、合成和代谢相关的GO术语和KEGG通路中。体液免疫反应、补体激活、中性粒细胞介导的免疫等GO术语的显著富集（FDR＜0.05）表明，免疫系统在维持乳腺组织在退化期间的健康和清除凋亡细胞方面发挥着重要作用。乳腺发育相关的基因模块分析则显示，妊娠激素受体蛋白、细胞生长因子及其受体、以及胰岛素样生长因子结合蛋白的编码基因通过适应性转录变化调节乳腺退化的生理过程。进一步的乳腺生长发育网络分析结果表明，ERBB4被确定为调节乳腺生长发育的核心基因，它在妊娠后期的乳腺组织中高表达。在体外培养的山羊乳腺上皮细胞中过表达ERBB4可调节PI3K-Akt信号通路，减少细胞周期G1/S期阻滞和细胞凋亡，促进乳腺上皮细胞增殖。此外，ERBB4基因还影响启动乳腺退化和促进乳腺细胞重塑的基因（STAT1、STAT3、STAT5B、BCL2L11、CAPN2和LGALS3）的表达。 2.miRNA分析结果显示，本研究成功构建9个小RNA文库，每个文库平均获得2,500万个干净读数且与山羊参考基因组的比对率≥65％。共鉴定了4,038个miRNA,包括3,129个已知miRNA和909个新预测的miRNA。这些miRNA被注释到385个miRNA家族，其中mir-10、let-7和mir-9家族中miRNA数量最多。此外，在3个不同发育阶段的乳腺组织中鉴定了754个差异表达的miRNA。根据miRNA表达量进行聚类分析，获得了6组具有独特表达模式的miRNA簇。簇1与簇4中miRNA在干奶期特异性高表达，其靶基因显著富集到调节细胞形态发生和细胞外基质组织生理过程中(FDR＜0.05),表明这些miRNA的功能可能与干奶期乳腺组织重塑过程相关。簇2与簇5中miRNA在干奶期特异性低表达，其靶基因一方面被显著富集到表皮生长因子受体信号通路和发育生长调节相关的生理过程中，另一方面与细胞凋亡和免疫相关的生理过程也被富集(FDR＜0.05),这可能与退化期的乳腺上皮细胞广泛凋亡有关。此外，簇3中miRNA在妊娠后期高表达，簇6中miRNA在泌乳末期高表达。其中，簇3中miRNA靶基因被富集到乳腺上皮细胞分化、跨突触信号的调节和柱状上皮细胞分化等生理过程，这与妊娠后期乳腺上皮细胞快速增殖和泌乳功能分化有关。簇6中miRNA靶基因被富集到外源性凋亡信号通路的调控、巨自噬的负调控和细胞对肽激素刺激的反应等生理过程。miRNA研究补充了非泌乳期山羊乳腺组织miRNA表达特征，展示了乳腺退化过程中与细胞生长、凋亡和物质代谢等相关的miRNA与及其靶基因之间的调控关系。 3.lncRNA分析结果显示，在非泌乳期山羊乳腺组织中鉴定出3,074个lncRNA且lncRNA的长度更短、外显子数量更少和表达水平普遍低于蛋白编码基因。在三个比较组(LLvs.DP、DPvs.LG和LLvs.LG)中鉴定出331个差异表达的lncRNA,这表明lncRNA在转录水平的表达量在乳腺退化过程中发生了变化。有趣的是，与哺乳期相比，lncRNA在干奶期的表达更为活跃，这表明乳腺lncRNA的表达具有发育时期特异性。GO注释和KEGG通路富集分析表明，lncRNA可以通过多种作用模式调节乳腺中的免疫功能、细胞增殖、凋亡、激素、物质代谢、运输和细胞间通讯等生理过程。其中，顺式作用的lncRNA在干奶期和妊娠后期增强了对乳腺健康的保护。此外，在与乳腺发育相关的lncRNA-miRNA-mRNA网络中，LOC102168552被鉴定为核心lncRNA,它在妊娠后期的表达量高于干奶期和泌乳末期，其表达量与PRLR呈显著正相关，与chi-miR-324-3p呈显著负相关(P.adj＜0.05)。于山羊乳腺上皮细胞原代细胞系的验证试验表明，LOC102168552可通过竞争性结合chi-miR-324-3p,上调PRLR并激活催乳素信号通路，促进细胞增殖，减少细胞周期停滞在G1/S期，以及抑制细胞凋亡。然而，单独过表达LOC102168552并不影响乳腺细胞生长状态和催乳素信号通路。这表明LOC102168552必须依赖chi-miR-324-3p来抑制乳腺细胞凋亡。 4.circRNA分析研究结果显示，本研究共鉴定出11,756个circRNA,其中2,528个circRNA在所有三个阶段均有表达。外显子circRNA数量最多，最少的是反义circRNA。circRNA来源基因分析发现，9,282个circRNA来源于3,889个基因，127个circRNA来源基因未知。组蛋白修饰、GTPase活性调控、细胞极性建立或维持等GO术语显著富集(FDR＜0.05)表明circRNA来源基因功能的多样性。在非泌乳期鉴定了218个差异表达的circRNA。在干奶期乳腺中特异性表达的circRNA数量最多，在泌乳末期最少。这些表明在不同发育阶段的乳腺组织中circRNA表达的时间特异性。此外，本研究还构建了与乳腺发育、免疫、物质代谢和细胞凋亡相关的circRNA-miRNA-mRNA竞争性内源性RNA调控网络。这些发现将有助于理解circRNA在乳腺细胞退化和重塑中的调节作用。 综上，本研究在非泌乳期奶山羊乳腺组织中鉴定出一批差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。发现与细胞生长、凋亡、免疫、营养转运、合成和代谢等相关的基因或者非编码RNA在非泌乳期发生适应性转录变化，它们对于乳腺退化和乳腺细胞重塑过程具有重要的调控功能。此外，本研究分别揭示了ERBB4和LOC102168552是参与山羊乳腺细胞生长调控的关键基因或lncRNA,能够通过调控PI3K-Akt信号通路影响山羊乳腺细胞生长状态和细胞周期。这些发现有助于深入了解奶山羊乳腺退化和重塑的分子调控机制。 收起