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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 在胚胎发生过程中,一个全能细胞会产生具有不同功能、形态和空间位置的细胞类型,这一过程主要受到基因转录层面的调控,因此识别不同细胞命运决定时的转录状态,对于理解和操纵细胞发育过程具有重要意义。之前的研究利用单细胞转录组学系统地揭示了... 展开 在胚胎发生过程中,一个全能细胞会产生具有不同功能、形态和空间位置的细胞类型,这一过程主要受到基因转录层面的调控,因此识别不同细胞命运决定时的转录状态,对于理解和操纵细胞发育过程具有重要意义。之前的研究利用单细胞转录组学系统地揭示了斑马鱼细胞命运决定的分子调控机制,但这些调控因子如何在空间上互作,以精确控制的方式诱导复杂的脊椎动物胚胎发育,是胚胎发生的基本问题之一,有待深入研究。 本研究利用转录组学和时空组学对受精后6个关键发育时间点3.3h、5.25h、10h、12h、18h和24h的斑马鱼胚胎进行分析,构建了斑马鱼早期胚胎发育的时空转录组图谱。接着应用SPOTlight将单细胞RNA测序(SinglecellRNAsequencing,scRNA-seq)和空间增强分辨率组学测序(spatialenhancedresolutionomics-sequencing,Stereo-seq)的数据进行整合分析,验证其二者的准确性。最后利用拟时序和基因差异表达分析,明确受精后3.3h和24h斑马鱼胚胎发育中的异质性。研究主要结果如下: 1.本研究空间组数据捕获了受精后3.3h、5.25h、10h、12h、18h和24h的斑马鱼胚胎共计139,391个位点,其中每个时间点的特异性分子标签(UniqueMolecularIdentifier,UMIs)数依次为:759个(3.3h),512个(5.25h),552个(10h),512个(12h),1569个(18h),2576个(24h)。在此基础上,我们搭建了斑马鱼早期胚胎发生时空转录组图谱。 2.转录组分析总捕获了受精后3.3h、5.25h、10h、12h、18h和24h的斑马鱼胚胎86307个细胞,鉴定了71种细胞类型,将不同发育时期的细胞通过统一流行逼近与投影(UniformManifoldApproximationandProjection,UMAP)获得可视化结果。 3.空间组测序结果区分出受精后3.3h斑马鱼胚胎具有三种不同空间分布的细胞类亚型:边缘胚裂块,浅表胚泡和深部胚泡。拟时序分析结果显示,分化顺序是由边缘胚泡到深部胚泡和浅表胚层。细胞类型特异性标记基因grhl3和thy1的原位杂交染色结果显示与测序数据分析结果一致。 4.SPOTlight整合分析结果显示3.3hpf胚胎中早期胚泡分布在胚胎的腹侧,而晚期的胚泡盘主要分布在背侧,结果与Stereo-seq数据中的空间位置高度一致。 5.对24hpf胚胎的神经系统进行无监督聚类分群分析,获得了神经系统精密空间转录组图谱。拟时序和基因表达差异分析了后脑神经干细胞和神经前体细胞,结合其空间位置信息,揭示了后脑神经干细胞的分化异质性空间分布。 6.使用原位杂交染色技术对关键调控基因ntl依赖基因5(ntd5)、E2F转录因子3(e2f3)、复制蛋白因子A3(rpa3)、凋亡诱导因子(siva1)在斑马鱼早期胚胎发育的表达进行验证,染色结果与空间组数据分析结果一致。 综上,本研究构建了斑马鱼早期胚胎发育的时空转录组图谱,揭示了后脑神经干细胞分化的空间异质性,并对调控早期发育的关键基因进行了表达验证,这将为进一步了解脊椎动物胚胎发育过程提供理论参考。为研究胚层分化、器官发生和细胞命运决定的细胞和分子机制提供了重要的参考资源。 收起
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