摘要: 背景和目的 乳腺腺上皮组织发生病变是乳腺癌诱发的主要原因。而99%的乳腺癌患者为女性，这一类恶性疾病已然严重威胁到了女性的生活与健康。目前手术治疗依旧是临床治疗乳腺癌的主要手段，如保乳手术，全身化疗以及放射疗法。但是诸如手术治疗可能... 展开 背景和目的 乳腺腺上皮组织发生病变是乳腺癌诱发的主要原因。而99%的乳腺癌患者为女性，这一类恶性疾病已然严重威胁到了女性的生活与健康。目前手术治疗依旧是临床治疗乳腺癌的主要手段，如保乳手术，全身化疗以及放射疗法。但是诸如手术治疗可能很难将肿瘤组织切除干净，并且可能存在脱落的肿瘤细胞而促使肿瘤发生转移。全身化疗以及放射疗法可能会带来严重的毒副作用，附加于患者一定的痛苦以及低劣的生活质量。因此很有必要开发出一种新型有效的治疗手段以弥补目前乳腺癌治疗的不足。 近年来，肿瘤光热治疗（PTT）以其独特的优势逐渐进入人们的视野。它主要运用光热剂在近红外激光的照射下，引起肿瘤组织部位高温，进而达到热消融肿瘤的目的。但是传统的光热治疗需要肿瘤中心温度达到50℃以上才具有很好的治疗效果。这可能会带来不必要的风险，比如损伤肿瘤组织周围的正常细胞，引发炎症反应，促进肿瘤迁移。同时传统的光热剂存在红外吸收能力差以及价格昂贵，存在潜在的毒性作用。据了解，细菌以及哺乳动物中广泛存在一种热应激蛋白70（Hsp-70），当机体暴露在高温环境下时，它便会大量表达提高细胞的耐热性以保护自身。因此抑制这种蛋白的表达可能会在一定程度上提高光热治疗的敏感性，降低光毒副作用。但是高浓度的热休克蛋白抑制剂可能会带来不必要的毒副作用。因此有必要引入新的手段以达到抑制热休克蛋白过度表达的目的。幸运的是，肿瘤饥饿疗法是利用切断肿瘤组织的能量供给进而达到“饿死”肿瘤细胞的目的。同时肿瘤细胞的快速增殖主要由乏氧糖酵解产生大量的三磷酸腺苷（ATP）来维持肿瘤细胞生存增殖的需要。而肿瘤细胞会通过糖酵解过程优先消耗葡萄糖来满足能量供给。遗憾的是这往往达不到理想的治疗效果，只能减缓肿瘤恶化的进程。但是，联合饥饿治疗这将可能会为提高光热治疗敏感性开辟新的治疗策略。 基于以上背景，我们设计了一种基于中空介孔二氧化硅纳米粒（HMSN）的多功能纳米粒子（GHT@HMSN），其中负载光热前药3,3'',5,5''-四甲基联苯胺（TMB）,辣根过氧化物酶（HRP）以及具有消耗葡萄糖的葡萄糖氧化酶(Gox).然后与具有温度敏感性的水凝胶PDLLA1500-PEG1500-PDLLA1500（PLEL）混合得到一种多功能纳米-凝胶体系（GHT@HMSN-PLEL）。GHT@HMSN-PLEL原位注射肿瘤组织中，细胞通过摄取体系中的纳米粒子。一旦GHT@HMSN进入肿瘤细胞中，首先，Gox通过氧化还原反应消耗葡萄糖，生成葡萄糖酸以及H2O2，阻断供应肿瘤细胞生长增殖的ATP水平，进一步使得一些生物大分子的表达受到抑制，诸如热激蛋白70（Hsp-70）。同时，单一的TMB并不具备作为光热剂的条件。而当暴露在H2O2的环境下时，在HRP的催化作用下，便可氧化为具有优异光热性质的氧化态TMB（OxTMB）。并且HRP的存在还可以氧化H2O2成O2和H2O，一定程度也缓解了肿瘤微环境的乏氧状态。本文希望通过Gox介导的饥饿疗法与光热治疗协同达到治疗乳腺癌的目的。实现1+1＞2，同时为临床研究提供一种新的治疗思路。 方法 采用模板法制备中空介孔二氧化硅纳米粒子（HMSN）并进行体外表征。 搅拌吸附Gox以及HRP，制备得多功能载药纳米粒子（GHT@HMSN），其他载药纳米粒子采用相似的装载策略。并进一步对这些载药纳米粒子采用相关表征手段。采用超声负压法先将光热前药TMB转载在HMSN中，然后进一步通过4℃ 采用开环聚合法合成分子量为4500Da，具有温度敏感性的PDLLA1500-PEG1500-PDLLA1500（PLEL）水凝胶。并用流变仪检测其温度敏感性。 采用葡萄糖刺激GHT@HMSN的策略，探究不同pH值对纳米粒子光热行为的影响，并用热成像仪记录体系的实时温度变化。 采用Transwell（Corning）co-culturesystem，探究4T1细胞对纳米粒子-凝胶体系摄取行为，并用荧光共聚焦显微镜（CLSM）以及TEM观察。 采用MTT法以及活死染色考察纳米粒子对4T1细胞的杀伤作用。 采用ATP检测试剂盒以及GSH检测试剂盒检测不同实验组对4T1细胞的ATP以及GSH表达水平影响。 采用免疫荧光技术观察不同治疗组对4T1细胞内的GSH以及Hsp-70表达水平情况。 采用皮下接瘤的方式建立小鼠乳腺癌皮下模型，并进行相关的抗肿瘤疗效评价实验。 采用热成像技术实时记录不同光照组小鼠肿瘤组织的温度变化。 采用Hamp;E染色切片法对考察体内抗肿瘤效果以及主要器官的毒性研究，同时采用免疫荧光染色对不同治疗组的肿瘤组织进行TUNEL，Ki-67以及Hsp-70实验。 结果 1．成功制备出了粒径均一、稳定性好、比表面积548.8763m2/g以及孔径为3.0±0.4nm的中空介孔二氧化硅纳米粒（HMSN） 2．通过一系列的负载策略，成功制备出了粒径大致为193.49nm,221.55nm,271.66nm的Gox@HMSN，HT@HMSN以及GHT@HMSN。其中粒径均一电位稳定。 3．通过TGA法测得Gox，HRP以及TMB的装载量为6.94%，1.55%以及10.69%，这与BCA法检测出的Gox，HRP以及H2SO4终止法检测出的TMB含量基本一致。 4．通过开环聚合法成功合成出分子量为4500的水凝胶PLEL，同时与纳米粒子交联后表现出与空白PLEL相似的温敏性质。 5．体外光热研究发现，Gox激活的GHT@HMSN在980nm激光器的照射下，相较于pH=7.2的中性环境，pH=6.0的微酸环境具有更优异的光热效果。 6．细胞摄取实验表明，4T1细胞对纳米-凝胶体系具有明显的摄取行为。 7．体外细胞实验结果显示，HMSN纳米粒生物相容性好，以及Gox介导的饥饿疗法结合PTT具有更优异的细胞杀伤作用。 8．体外细胞检测结果发现，经过Gox处理的细胞，其细胞内表达的ATP水平以及Hsp-70水平得到了明显的抑制。 9．通过GSH检测试剂盒发现，GHT@HMSN治疗组能下调GSH的水平。 11.给药16天后，安乐死治疗小鼠，发现联合治疗高浓度组（3次PTT）以及中浓度组（3次PTT）能实现肿瘤的完全热消融。 10.成功构建Balb/c荷瘤小鼠皮下乳腺癌模型，研究发现，纳米-凝胶体系原位给药24h后激光照射肿瘤部位具有明显的温度变化。同时第4，7天还能维持良好的光热治疗效果。 12.生存曲线考察发现，联合治疗中浓度组（3次PTT）具有更长的存活时间，且40天考察发现肿瘤复发率仅为20%。 13.Hamp;E组织病理扫描切片结果显示，联合治疗肿瘤组织表现出最大程度的组织损伤，而其他组织（心肝脾肺肾）与空白PBS组基本相像，并没有发现明显的组织病变情况。 14.TUNEL，Ki-67肿瘤组织免疫荧光结果显示，联合治疗具有最大程度的增殖抑制以及凋亡导向。Hsp-70免疫荧光发现，体内检测结果与体外抑制表达基本一致。 结论 综上，体内体外研究表明，Gox介导的肿瘤饥饿疗法具有阻断肿瘤细胞ATP的生成进而抑制Hsp-70的表达，使得肿瘤细胞的耐热性变差。联合治疗在葡萄糖的存在以及微酸环境的刺激下表现出优异的光热效果。克服了由于传统光热治疗需要达到高温才能有效消融肿瘤细胞的不足，最终在大约48℃的治疗温度（3次PTT）下使得肿瘤完全消融。为临床提供一种新型有效的治疗思路。 收起