摘要: 制革过程中所用原料皮的主要成分为胶原。胶原因其独特的三股螺旋结构而具有优良的生物学性能，在医药、食品和生物材料等领域发挥着举足轻重的作用。已有研究表明，从不同生物提取获得的胶原热稳定性存在较大差异，可能与其分子序列中羟脯氨酸含量及... 展开 制革过程中所用原料皮的主要成分为胶原。胶原因其独特的三股螺旋结构而具有优良的生物学性能，在医药、食品和生物材料等领域发挥着举足轻重的作用。已有研究表明，从不同生物提取获得的胶原热稳定性存在较大差异，可能与其分子序列中羟脯氨酸含量及其他氨基酸组成密切相关，但现有实验手段无法进一步阐明影响胶原三股螺旋结构稳定的内在机制。随着计算模拟技术的快速发展激发研究者们通过构建蛋白质模型，从原子尺度分析氨基酸残基对蛋白质结构的影响。已有的研究主要是基于胶原的典型氨基酸序列(Gly-Pro-Hyp)n合成具有三股螺旋结构的类胶原短肽，结合计算模拟通过替换序列中的单个氨基酸残基剖析其对三股螺旋结构稳定性的影响。然而，由于类胶原短肽的氨基酸序列与天然胶原存在较大差异，其序列结构与天然胶原不完全吻合，也就无法阐释天然胶原结构的稳定机制，如分析羟脯氨酸含量与胶原热稳定性关系的原因。如果模型的构建是基于天然胶原分子的氨基酸序列，则有望能够更有效地分析探究天然胶原分子三股螺旋结构的稳定机制。本论文首先对比研究哺乳类及鱼类胶原基本性能的差异，统计分析两类胶原的氨基酸序列及组成特征。引入计算模拟技术，基于胶原天然氨基酸序列构建三股螺旋结构模型并验证其合理性。在此基础上，采用传统实验与计算模拟探究羟脯氨酸含量及其他氨基酸残基对于胶原三股螺旋结构稳定性影响的内在机制；并结合实际应用，将胶原模型引入水溶剂体系，进一步完善胶原天然结构的稳定机制。此外，运用建立的模型探究不同醇类对胶原材料性能的影响及作用机理，为胶原基材料的拓展应用提供理论指导。 选择牛皮、鲶鱼皮和草鱼皮三种不同生物提取的胶原作为研究对象。紫外及红外光谱实验结果表明，经纯化后提取获得的胶原纯度较高且三股螺旋结构完整。扫描电镜实验结果表明，牛皮胶原的外观平均孔隙大小为292.61±33.53μm，大于鱼皮胶原。差示扫描量热仪测试及羟脯氨酸含量测定结果表明，三种胶原的热稳定性与其羟脯氨酸含量呈正相关，牛皮、鲶鱼皮和草鱼皮胶原的热变性温度分别为39.9，33.9和30.3℃。为探究胶原性能差异的根本原因，对牛皮与草鱼皮胶原氨基酸序列进行统计分析。结果表明，胶原两条α链高度同源，相同位置的氨基酸残基基本一致。另外，两种胶原序列中各类氨基酸的分布规律也相似：亚氨基酸及丙氨酸均匀分布于全序列中，且Yaa位置的脯氨酸被羟基化为羟脯氨酸；酸性及碱性氨基酸分布遵循高度同源、分布集中的原则，三条α链同一编码位置一般出现相同的酸碱氨基酸；强疏水性氨基酸（如苯丙氨酸、亮氨酸）只在Xaa位置出现，且集中分布以形成局部疏水环境。两种胶原氨基酸序列的差异主要体现在部分氨基酸的占比上。例如牛皮胶原中亚氨基酸含量明显高于草鱼皮胶原，而草鱼皮胶原中丙氨酸的含量要高于牛皮胶原。上述差异可能是导致胶原性能不同的根本原因。 为了进一步探究胶原分子序列中各类氨基酸对其性质的影响。采用Materials Studio6.0软件包对分子进行模型构建。结合已有胶原分子的结构参数，确定胶原三条α链的排布方式和链间氢键连接方式。模型的能量优化算法结果表明，经最速下降法（steepest descent）优化过程中所占用的计算资源最少且体系结构最稳定。模型电荷赋予方式筛选结果表明，以Charge using Gasteiger赋予电荷后模型能量结果最精确。各类力场优化结果表明，Dreiding力场的输出结果适合模型结构稳定性分析。通过优化后的各项参数构建获得具有天然氨基酸序列的胶原三股螺旋结构模型，为后续计算模拟实验提供基础。 目前，研究者普遍认为胶原分子的结构稳定性与羟脯氨酸含量有关，但两者的具体联系及影响机制尚不明晰。因此，本文依据前期提出的胶原建模方法和参数，构建了4组羟脯氨酸含量分别为4.4、7.8、11.1和15.6%的草鱼皮胶原模型。拟合计算获得了胶原分子链间氢键能量为17.74J/g。差示扫描量热仪测试表明，草鱼皮冻干胶原和溶液的氢键断裂能量分别为18.38和17.98J/g，验证了所建模型的合理性。各模型的升温动力学模拟结果表明，随着羟脯氨酸含量的增加，模型于308K环境中链间氢键能量的下降值分别为14.251、10.352、7.970、1.247kcal/mol，表明其热稳定性逐渐上升。此外，对长片段胶原模型热变性过程模拟结果表明，胶原分子变性过程中三股螺旋结构的开链并不是同时发生的，是在羟脯氨酸含量较少的不稳定区域先发生链结构的破坏。随后，构建10组牛皮胶原模型对结果进行验证。结果表明，在羟脯氨酸含量相同的情况下，牛皮胶原模型的链间氢键作用普遍强于草鱼皮胶原。其中5组羟脯氨酸含量均为10%的模型氢键能量上下波动，且波动范围超出了羟脯氨酸含量的改变幅度。由此可以推测，羟脯氨酸含量仅为影响胶原结构稳定性的一种因素，其他氨基酸的含量及分布也会对胶原稳定性产生影响。 为了进一步探究胶原分子序列中各类氨基酸对其结构稳定性的影响。统计分析20种常见氨基酸在牛皮胶原三肽中Xaa与Yaa位置的分布情况。根据结果选取了出现概率较高（总占比62.9%）的前20种“优势三肽”作为研究对象，并筛选13组序列构建模型。各模型优化后的能量分析结果表明，疏水性氨基酸的存在会提高模型的键角能而不利于链结构的稳定。亚氨基酸中的吡咯环通过提高链段的刚性而利于结构稳定，模型链间的氢键作用主要与羟脯氨酸含量呈正相关。同时，酸碱性氨基酸及亲水性氨基酸含量的提高也能加强模型链间的氢键作用。另外，模型侧链间的静电相互作用也有利于胶原结构的稳定，此部分作用主要与序列中的酸性及碱性氨基酸的数量与分布相关。各模型结构优化后的分子尺寸统计结果进一步验证了模型的能量结果分析。模型中各“优势三肽”微环境内的结构稳定机制分析表明，当羟脯氨酸附近存在酸碱性氨基酸或亲水氨基酸时，能够通过形成额外氢键来稳定胶原结构。酸碱性氨基酸若集中分布且相邻氨基酸带相反电荷时，侧链R基之间的静电相互作用能够提高链结构的稳定；而相同电荷所带来的排斥作用则不利于结构稳定。疏水氨基酸是由于相互聚集形成疏水空腔而致使胶原链骨架的扭曲。各模型的升温结果进一步验证了上述机理。 由于胶原基材料的生产、加工和制备过程都涉及到溶液状态。因此，胶原分子在溶液中的稳定机制尤为重要。本文将胶原模型引入水溶液体系，基于各类氨基酸对其结构稳定性的研究基础之上，研究水分子对胶原结构稳定性的影响机制。水分子的径向分布函数结果表明，三肽微环境通过扰动水合层来影响胶原结构的稳定性。丝氨酸在Xaa位置表现为亲水性，而在Yaa位置体现为疏水性。酸碱性氨基酸均能体现出良好的亲水性能，且在Xaa位置的亲水性更佳。但是连续的酸性或碱性氨基酸因侧链相互排斥而不利于结构的稳定。丙氨酸在Yaa位置表现出的疏水性强于Xaa位置；亮氨酸和苯丙氨酸在Xaa位置具有很强的排斥水分子的能力。在胶原中分布最广的GPO三肽中，脯氨酸与羟脯氨酸分别表现出疏水和亲水性能。GPO三肽周围的水分子能够参与链间水桥键的形成来提高结构的稳定性。模型升温前后链间氢键数目及结构变化结果证实了上述机制。即微环境的亲水性能通过稳定水合层提高结构稳定性，而疏水区域水合层的破坏则不利于链结构的稳定。 基于构建的胶原模型，结合传统实验和计算模拟的方法系统研究不同碳链长度及羟基位置和数目的醇对于胶原性质的影响及作用机理。超灵敏微量差示扫描量热仪测试结果表明，一羟基醇能降低胶原的热变性温度，随着醇分子碳链的增长，胶原的变性温度由42.43℃逐渐下降至37.85℃（正丁醇体系）。多羟基醇能提高胶原的热变性温度，且随着醇分子中羟基数目的增加而更加明显。值得注意的是，同样存在两个羟基的1，2-丙二醇（42.96℃）与1,3-丙二醇（42.25℃）对胶原的热变性温度表现出了相反作用。内源荧光及粒径分布分析结果表明，胶原分子在溶液中的聚集行为受不同醇体系的影响且影响规律几乎与热稳定性一致。即醇分子碳链的增长，利于胶原聚集而羟基数目的增多有利于胶原分子在溶液中分散。同样的，1，2-丙二醇和1,3-丙二醇体系亦表现出特殊规律。结合计算模拟探究醇与胶原分子的作用机制。溶解自由能计算结果印证了胶原分子在不同醇体系中的聚集行为规律。径向分布函数结果表明，随着醇分子碳链的增长，水分子的g（x）由1.40下降至0.92；而随着羟基数目的增加，g（x）从1.00上升至1.42。表明醇分子因疏水性破坏胶原分子周围水合层而致使其结构不稳定。各体系平衡后胶原分子的结构分析再次印证了超灵敏微量差示扫描量热仪的测试结果。各类醇分子与胶原的作用机理分析表明，溶液中的醇分子、醋酸根和氢离子能在胶原分子之间形成复杂的网状桥键结构。这种网状桥键结构在不同胶原分子的α链间拉扯，促进了分子的聚集而不利于三股螺旋结构的稳定。链间的网状桥键结构会随着醇分子碳链的增长而变大。羟基数目的增加则不利于网状结构的形成。特殊的是，1,3-丙二醇由于其羟基位于分子两端，体系中形成的网状桥键结构向多个链状桥键结构转变，从而表现出特殊的影响规律。 收起