摘要: 日本沼虾（Macrobrachium nipponense）又名河虾，是中国重要的淡水经济养殖类之一，环境的恶化以及外界病原体的入侵，直接影响了日本沼虾的养殖经济。酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）系统的激活是甲壳动物抵御外源病原体重要的免疫反应，其中... 展开 日本沼虾（Macrobrachium nipponense）又名河虾，是中国重要的淡水经济养殖类之一，环境的恶化以及外界病原体的入侵，直接影响了日本沼虾的养殖经济。酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）系统的激活是甲壳动物抵御外源病原体重要的免疫反应，其中，酚氧化酶激活因子（prophenol oxidase activation factor，PPAF）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor，Serpin）是该系统中的重要组成成分，但在日本沼虾表皮中的研究较少。为了探究它们的功能，本论文在前期转录组测序的基础上，采用RACE的方法，首次从日本沼虾腹部背表皮中克隆出一条酚氧化酶激活因子（命名为MnPPAF1）和两条丝氨酸蛋白酶抑制剂（命名为MnSerpin1和MnSerpin2）的cDNA的全长；利用生物信息学的方法分析结构特征及预测功能；使用RT-PCR和qRT-PCR检测了MnPPAF1、MnSerpin1、MnSerpin2的时空分布的情况；分别通过嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）侵染、dsRNA介导的基因沉默技术，初步研究了表皮MnPPAF1、MnSerpin1在日本沼虾免疫中的作用，探讨了咪唑类物质KK-42对上述基因表达的诱导效应。具体结果如下： （1）从日本沼虾表皮克隆的cDNA序列全长，分别命名为MnPPAF1、MnSerpin1、MnSerpin2，cNDA序列全长分别为1718 bp、2181 bp、2597 bp，ORF开放阅读框分别为1383 bp、1260 bp、1230 bp，分别对应编码了460、419、409个氨基酸，理论等电点（pI）分别是5.13、5.29、5.72，分子质量分别是49.34 kDa、45.99 kDa、45.78 kDa；分别含有4、3、6个N-连接的糖基化位点和12、7、2个O-连接的糖基化位点。多序列比对发现：MnPPAF1与斑节对虾（ Penaeus monodon）相似性最高为66.38%，MnSerpin1与克氏原螯虾（Procambarus clarkii）相似性最高为50.75%，MnSerpin2与南白美对虾（Penaeus vannamei）相似性最高为76.28%；分别与对虾属的PPAFs、甲壳动物的Serpins存在较近的进化关系。 （2）MnPPAF1、MnSerpin1和MnSerpin2均在表皮表达，此外，在鳃、胃、心、肝胰腺、血淋巴（MnPPAF1与MnSerpin1）以及鳃、肝胰腺、血淋巴（MnSerpin2）也有表达。在所观察的蜕皮周期中，上述基因的表达呈波动性变化：以蜕皮间期（C期）为对照，表皮MnPPAF1在蜕皮前晚期（D4期）和蜕皮后早期（A期）的表达量较高，蜕皮后晚期（B期）较低；表皮MnSerpin1在A期表达最高，而MnSerpin2仅在蜕皮前早期（D0期）和D4期表达量较高。提示：上述基因表达的变化可能与蜕皮周期过程中表皮上皮细胞活性的变化有关。 （3）嗜水气单胞菌攻毒对表皮MnPPAF1表达的诱导效应出现在攻毒后早期，在3 h相对表达量显著升高，6 h达到最高（升高2.27倍）；同时，表皮PO酶活力也呈现类似的变化趋势。嗜水气单胞菌对表皮MnSerpin1的诱导效应出现在攻毒后6~48 h，6 h的相对表达量达到最高（升高2.78倍），PO酶活力在攻毒后6 h、12 h显著升高且在12 h达到最高。而嗜水气单胞菌对表皮MnSerpin2的诱导效应较弱，MnSerpin2仅在6 h的相对表达量有所升高（升高0.44倍）。攻毒后120 h，日本沼虾的死亡率为58%，而对照组仅为2%。 （4）RNA干扰实验结果显示：双链RNA（dsMnPPAF1、dsMnSerpin1）干扰后，MnPPAF1和MnSerpin1的转录量分别降低了71.79%和35.9%，PO酶活力也均降低；与对照组相比，攻毒后动物的死亡率分别升高了26%、7.78%。结果提示：表皮MnPPAF1和MnSerpin1参与日本沼虾proPO系统的激活，从而提高了动物的免疫力。 （5）咪唑类物质KK-42对表皮MnPPAF1、MnSerpin1以及MnSerpin2均具有诱导效应。MnPPAF1表达量在KK-42处理后3 h和6 h（为对照组的1.4倍）显著升高，表皮PO活力在12 h达到最高。MnSerpin1、MnSerpin2的相对表达量在6 h最高，较对照组分别升高1.55倍、1.11倍，表皮PO酶活力也有类似的变化趋势。 KK-42预处理+嗜水气单胞菌攻毒对上述基因的诱导效应均强于KK-42预处理或者嗜水气单胞菌攻毒。在KK-42+攻毒组中，表皮MnPPAF1的相对表达量在攻毒后3~24 h高于攻毒组，且6 h表达最高（P＜0.01），PO活力与基因表达的趋势类似，在12 h达到最高。与攻毒组相比， KK-42+攻毒组MnSerpin1、MnSerpin2的表达量分别在3~6 h和3~12h、48 h显著升高，PO活力在12~48 h显著升高。同时，KK-42+攻毒组动物死亡率较攻毒组降低了16%。上述结果表明：KK-42诱导MnPPAF1、MnSerpin1、MnSerpin2表达，导致PO活力升高，这可能是嗜水气单胞菌攻毒后日本沼虾死亡率降低的重要因素之一。 综上所述，MnPPAF1、MnSerpin1、MnSerpin2参与日本沼虾酚氧化酶原激活系统的激活，作为表皮内重要的免疫分子，其表达的升高能显著降低嗜水气单胞菌攻毒后动物的死亡率。 收起