摘要: 目的： 晚期糖基化终末产物（advanced glycation end prodμcts,AGEs）可以介导细胞内氧化应激和炎症的持续激活，是糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）进展中的关键致病因子，在DKD发展中足细胞是主要受损细胞。细胞焦亡是主要依赖炎... 展开 目的： 晚期糖基化终末产物（advanced glycation end prodμcts,AGEs）可以介导细胞内氧化应激和炎症的持续激活，是糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease,DKD）进展中的关键致病因子，在DKD发展中足细胞是主要受损细胞。细胞焦亡是主要依赖炎性半胱天冬氨酸-1,4,5,11（caspase-1,4,5,11）激活并伴大量促炎症因子释放的级联反应，在多种炎症性疾病的发生发展中起重要作用。NIMA相关蛋白激酶7(NEK7)在调节细胞周期和有丝分裂期间纺锤体的形成起关键作用。据文献报道NEK7是炎性小体3（NLRP-3）激活的核心分子，在细胞焦亡的通路中起关键作用。细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)是一种转录调控因子，通过磷酸化RNA聚合酶II来促进转录延长，主要是炎症反应中基因的转录。因此，我们推测在AGEs诱导的DKD中，CDK9通过调控NEK7/NLRP-3信号通路诱导足细胞焦亡，导致足细胞损伤。本研究通过制备AGEs诱导足细胞损伤，观察AGEs是否可以介导足细胞焦亡的发生，继而探讨CDK9/NEK7/NLRP-3信号通路在足细胞损伤中的作用及机制。 方法： 建立AGEs诱导的足细胞损伤模型。1)观察不同AGEs浓度（0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）对足细胞（MPC5）焦亡的作用;2)采用RNA-seq技术筛选AGEs干预足细胞后mRNA表达谱，发现NEK7表达显著上调；观察NEK7在AGEs诱导足细胞损伤和焦亡中的作用：首先，检测NEK7在AGEs诱导的足细胞及DKD肾脏组织中的表达水平；接着，分别采用RNA干扰技术（siRNA）敲减NEK7和基因转染技术过表达NEK7，检测NEK7在AGEs诱导的足细胞损伤和焦亡作用;3)采用生物信息学技术预测NEK7的潜在转录因子，发现NEK7启动子区域存在CDK9的转录结合位点；观察CDK9在AGEs诱导足细胞损失和焦亡中的作用：首先，检测CDK9在AGEs诱导的MPC5细胞及DKD肾脏组织中的表达水平；接着，分别采用RNA干扰技术（siRNA）敲减CDK9和基因转染技术过表达CDK9，检测CDK9在AGEs诱导的足细胞损伤和焦亡作用。采用细胞免疫荧光检测足细胞中Podocin、Desmin的表达水平，分别采用免疫蛋白印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测NLRP-3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、Podocin、NEK7的蛋白和mRNA表达水平，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养上清液IL-18和IL-1β的浓度，采用免疫组化法检测DKD肾脏组织中NEK7、CDK9的表达水平。 结果： 1）在细胞模型中发现AGEs可以诱导足细胞焦亡的发生，NLRP-3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达呈浓度梯度递增；2)在AGEs诱导的足细胞焦亡中NEK7表达增加，DKD肾脏组织中NEK7阳性面积明显增加；NEK7基因沉默后焦亡相关指标（NLRP-3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β、IL-18）显著下降，Podocin表达增加，Desmin表达降低，足细胞损伤降低，而转染过表达NEK7质粒后，NLRP-3、GSDMD、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达明显增加，Podocin表达降低，Desmin表达增强，足细胞损伤增强；3)AGEs诱导的足细胞焦亡中，CDK9表达增加，在DKD样本中CDK9表达增加；CDK9基因沉默后焦亡相关指标显著下降，NEK7表达降低，Podocin表达降低，Desmin表达增加，足细胞损伤降低；过表达CDK9后结果则相反,足细胞损伤增加。 结论： 本研究结果表明，AGEs可以通过诱导足细胞焦亡导致足细胞损伤，其机制可能是NEK7介导足细胞焦亡，上调NEK7焦亡指标相关表达增强，从而造成足细胞损伤；CDK9调控NEK7/NLRP-3信号通路上调CDK9足细胞焦亡相关水平表达显著增强，造成肾脏损伤。本研究为足细胞焦亡在DKD进展中的机制研究提供新方向。 收起