摘要: 背景和目的脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是由于各种原因所致的脊髓神经细胞死亡，从而造成轴突断裂以及神经脱髓鞘反应，最终结果使神经功能传导受阻、机体感觉和运动功能障碍,是一种中枢神经系统疾病，对患者身心健康以及日常生活活动造成严重伤... 展开 背景和目的脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是由于各种原因所致的脊髓神经细胞死亡，从而造成轴突断裂以及神经脱髓鞘反应，最终结果使神经功能传导受阻、机体感觉和运动功能障碍,是一种中枢神经系统疾病，对患者身心健康以及日常生活活动造成严重伤害和极大负担。目前尚无有效的治疗方法。研究发现，氧化应激（Oxidativestress，OS）在SCI的病理生理过程中发挥重要作用。氧化应激可产生过量的过氧化氢和活性氧族（reactiveoxygenspecies，ROS），是导致少突胶质细胞（Oligodendrocyte，OLs）损伤的主要原因。少突胶质细胞是由少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursorcells，OPCs）分化后成熟而形成的，是中枢神经系统参与形成轴突髓鞘的细胞。高代谢、高耗氧致使OPCs细胞更易受到氧化应激的损伤。因此，减轻少突胶质前体细胞的氧化损伤，进而促进轴突重新髓鞘化是寻找SCI治疗药物的重要靶点。白术内酯Ⅲ(AtractylenolideⅢ，ATL-Ⅲ)为中药白术中提取的一种天然活性小分子化合物，具有抗脂质过氧化、抗炎等药理作用。有研究表明ATL-Ⅲ具有改善痴呆模型大鼠学习记忆功能，但就目前所知的报道中，ATL-Ⅲ对于脊髓损伤的作用报道甚少。本研究应用大鼠脊髓损伤的动物模型及体外OLN-93细胞（大鼠少突胶质前体细胞），从体内和体外实验两方面探索ATL-Ⅲ的神经保护作用，希望为SCI的药物治疗提供科研思路和新的理论依据。 方法 1、体外实验。1)首先建立细胞氧化应激模型并且确定孵育药物适宜浓度:用不同浓度的白术内酯Ⅲ，孵育OLN-93细胞24小时并且采用经典CCK-8法检测白术内酯Ⅲ药物毒性；用不同浓度的过氧化氢(H2O2)损伤诱导细胞，采用CCK-8法，确定细胞损伤诱导的最适浓度以及处理最适时间；采用所测得的最适宜损伤浓度处理细胞1小时，再用不同浓度的白术内酯Ⅲ孵育24小时，采用CCK-8法确定最适合的白术内酯Ⅲ浓度。2）应用光学显微镜和HE染色法对各组细胞的数量及形态变化进行观察并记录。3）乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，用来检测不同组LDH的释放量。4）为了检测各组活性氧的释放量，使用活性氧试剂盒，通过荧光酶标仪和荧光显微镜。5）提取各组蛋白，应用丙二醛(MDA)含量测定法，检测不同处理组细胞脂质过氧化程度。6）使用TUNEL试剂盒/DAPI荧光双染等方法对于各组不同的TUNEL表达情况进行检测。7）使用Hoechst33342活性细胞染色剂，观察并记录细胞核的形态变化。8）使用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪和荧光双染方法，检测各组细胞凋亡变化。9）通过荧光显微镜和荧光酶标仪对各组线粒体膜电位(MMP)，用JC-1荧光探针进行检测。10）蛋白质免疫印迹（WesternBlot）方法检测氧化相关蛋白（SOD1、SOD2、INOS）、凋亡相关蛋白（P53、Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、P-AKT、Caspase9、Caspase3）的表达情况。 2、体内实验。1）建立大鼠脊髓损伤模型，用白术内酯Ⅲ治疗7天，分别于损伤后1、3、7、10、14、21和28天进行BBB行为学检测评分。2）取材损伤后7天脊髓组织，提取各组组织蛋白，WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、AKT、P-AKT、Caspase9、Caspase3）、氧化相关蛋白（INOS、SOD1、SOD2）的表达情况。3）应用Western-blot方法，检测损伤脊髓组织中少突胶质细胞特异性蛋白—髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein，MBP）蛋白水平的表达。结果 1.通过CCK-8法分析检测细胞活力率，表明了白术内酯Ⅲ对于由H2O2造成损伤的细胞具有显著的正向保护作用。2.细胞形态学结果显示，白术内酯Ⅲ能明显改善损伤细胞的皱缩、碎裂、坏死等形态变化。3.检测LDH结果表明，白术内酯Ⅲ能降低由于H2O2造成损伤后细胞释放LDH量作用较为明显，维持细胞完整性。4.检测ROS结果表明，白术内酯Ⅲ能显著降低由H2O2诱导的OLN-93的ROS释放量。5.MDA结果显示，白术内酯Ⅲ可显著减少H2O2诱导的MDA产量。6.TUNEL/DAPI荧光双染检测表明，白术内酯Ⅲ能降低经由H2O2诱导的TUNEL表达量，这表明白术内酯Ⅲ可明显抑制了细胞凋亡。7.Hoechst33342染色结果表明，H2O2损伤组的细胞核不同程度呈现出皱缩、碎裂等凋亡形态，白术内酯Ⅲ能阻止细胞发生凋亡。8.流式细胞仪检测细胞凋亡（AV/PI）以及荧光双染结果显示，H2O2处理后细胞凋亡数量增多，白术内酯Ⅲ能明显减少凋亡的细胞数。9.MMP检测结果显示，白术内酯Ⅲ能明显抑制损伤细胞线粒体膜电位的降低。10.WesternBlot检测结果表明白术内酯Ⅲ能降低INOS表达，增强抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2)活性，并且能降低促凋亡蛋白(PI3K、Bax、P53、Caspase3、Caspase9)表达，提高抗凋亡蛋白Bcl-2和P-AKT表达。11.对脊髓损伤模型大鼠进行BBB评分，结果表明白术内酯Ⅲ治疗后，大鼠在损伤后7、10、14、21、28天的评分均高于未治疗组。12.脊髓组织WesternBlot检测结果表明，白术内酯Ⅲ治疗组中抗氧化蛋白（SOD1、SOD2）和抗凋亡相关蛋白(Bcl-2、P-AKT）的表达明显高于未治疗组；而促凋亡蛋白（Bax、Caspase3、Caspase9）和INOS蛋白的表达低于未治疗组。13.脊髓组织中WesternBlot检测结果表明，白术内酯Ⅲ治疗组可以显著增加损伤脊髓组织中MBP蛋白水平的表达，激活少突胶质细胞增殖，形成新的轴突。 能阻止细胞发生凋亡。8.流式细胞仪检测细胞凋亡（AV/PI）以及荧光双染结果显示，H2O2处理后细胞凋亡数量增多，白术内酯Ⅲ能明显减少凋亡的细胞数。9.MMP检测结果显示，白术内酯Ⅲ能明显抑制损伤细胞线粒体膜电位的降低。10.WesternBlot检测结果表明白术内酯Ⅲ能降低INOS表达，增强抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2)活性，并且能降低促凋亡蛋白(PI3K、Bax、P53、Caspase3、Caspase9)表达，提高抗凋亡蛋白Bcl-2和P-AKT表达。11.对脊髓损伤模型大鼠进行BBB评分，结果表明白术内酯Ⅲ治疗后，大鼠在损伤后7、10、14、21、28天的评分均高于未治疗组。12.脊髓组织WesternBlot检测结果表明，白术内酯Ⅲ治疗组中抗氧化蛋白（SOD1、SOD2）和抗凋亡相关蛋白(Bcl-2、P-AKT）的表达明显高于未治疗组；而促凋亡蛋白（Bax、Caspase3、Caspase9）和INOS蛋白的表达低于未治疗组。13.脊髓组织中WesternBlot检测结果表明，白术内酯Ⅲ治疗组可以显著增加损伤脊髓组织中MBP蛋白水平的表达，激活少突胶质细胞增殖，形成新的轴突。 结论 白术内酯Ⅲ可显著抑制过氧化氢诱导的大鼠少突胶质前体细胞的氧化损伤，在大鼠脊髓损伤模型中，白术内酯Ⅲ能明显促进SCI大鼠运动神经功能的恢复。白术内酯Ⅲ的保护作用可能是通过减轻损伤组织细胞中的氧化应激反应保护少突胶质细胞，抑制细胞凋亡的发生。初步推测，其作用与PI3K/AKT信号通路密切相关。本研究结果提示白术内酯Ⅲ具有潜在的神经保护作用，可为脊髓损伤或其他相关神经退行性疾病的药物治疗提供新策略。 收起